孫姍姍 王廷峰

摘 要：藍(lán)玉簪龍膽為龍膽屬的常見種之一，青藏高原特有物種。本研究通過對藍(lán)玉簪龍膽6個個體進(jìn)行ITS序列的克隆與測序，得到8條序列，長度為644～651bp，包含48個堿基突變和11個缺失/插入，共鑒定出7個單倍型。通過克隆序列構(gòu)建藍(lán)玉簪龍膽及其近緣物種線葉龍膽的系統(tǒng)發(fā)育樹，2個物種可形成2個支系，但藍(lán)玉簪龍膽大部分單倍型仍鑲嵌在線葉龍膽支系內(nèi)。本研究獲得的藍(lán)玉簪龍膽ITS序列及其分化分析為龍膽屬進(jìn)化研究提供了參考。

關(guān)鍵詞：藍(lán)玉簪龍膽;ITS;克隆;遺傳分化

中圖分類號：S-3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ??DOI：10.19754/j.nyyjs.20191030005

引言

龍膽屬植物是典型的高山植物，以青藏高原及其周邊地區(qū)為分布中心和分化中心[1，2]。藍(lán)玉簪龍膽（Gentiana veitchiorumHemsl.）多年生草本，生長于海拔4000～5000m的草甸或灌叢中，隸屬于龍膽屬多枝組，是青藏高原特有植物，也是多枝組中的常見物種，是高山草甸的重要組成部分。藍(lán)玉簪龍膽花色素雅，形態(tài)優(yōu)美，具有較高的園藝觀賞價值，已被用于園藝栽培。進(jìn)化研究表明，藍(lán)玉簪龍膽的葉綠體基因組存在基因缺失[3]，目前缺乏其群體遺傳學(xué)研究[4]。

青藏高原是全球生物多樣性熱點(diǎn)地區(qū)之一，是維管束植物的多樣性中心之一，是我國植物資源重要的“基因庫”，有很高的生物多樣性。同時，青藏高原具有數(shù)量眾多的特有種，比如龍膽屬、虎耳草屬、杜鵑花屬和馬先蒿屬等類群。此外，青藏高原的植物在研究植物區(qū)系起源和演化具有重要價值，整個東亞植物區(qū)系至少在其西部是以橫斷山至喜馬拉雅為中心而發(fā)展起來的。

隨著分子生態(tài)學(xué)的發(fā)展，結(jié)合遺傳結(jié)構(gòu)與歷史地質(zhì)事件，解決物種的種群歷史演化過程及成因。在進(jìn)化生物學(xué)中，ITS序列，即18S-5.8S-26S 核糖體DNA的基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（nuclear ribosomalInternal Transcribed Spacer），是十分常用的分子標(biāo)記。高等植物的核糖體DNA由18S rDNA、ITS1、5.8S rDNA、ITS2和26S rDNA組成，再由成百上萬個基本單元串聯(lián)成重復(fù)序列。ITS序列作為核基因分子標(biāo)記有如下優(yōu)點(diǎn)：被子植物的ITS長度穩(wěn)定，一般在600～700bp間;基因序列比較保守，設(shè)計的通用引物在不同物種中均可擴(kuò)增;進(jìn)化速率較大，可提供豐富的系統(tǒng)發(fā)育信息，是重要的Barcoding標(biāo)記，能較好的反應(yīng)種間關(guān)系。其在種內(nèi)居群也往往存在豐富的變異，可用于群體遺傳學(xué)研究。因此，ITS已經(jīng)成為被子植物分子系統(tǒng)學(xué)和群體遺傳研究中應(yīng)用最廣的核基因分子標(biāo)記。此外，ITS還可以用于檢測雜交事件，推測親本序列，在揭示雜交等復(fù)雜進(jìn)化過程中具有重要作用。

本研究以藍(lán)玉簪龍膽的3個居群為研究對象，通過對部分個體進(jìn)行單克隆測序，探討藍(lán)玉簪龍膽ITS序列的基本特征及其與近緣種的遺傳分化，研究結(jié)果將為龍膽屬植物的進(jìn)化研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在四川和西藏的高山草甸上采集藍(lán)玉簪龍膽3個居群（Fu2016036，四川色達(dá);Fu2016175，西藏芒康;Fu2017207，西藏林周）6個個體，憑證標(biāo)本保存在洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院標(biāo)本館。樣品采集，保證居群內(nèi)每個個體間距至少10m，以防止克隆體;選擇開花的成熟植株，選取幼嫩的葉子用干燥硅膠快速干燥，密封保存于-20℃中。

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增與序列克隆

通過CTAB法[5]從干燥的植物葉片中提取總DNA，用1%瓊脂糖檢測提取質(zhì)量。選用通用的ITS1a-ITS4引物[6]，擴(kuò)增體系和擴(kuò)增反應(yīng)見表1。將PCR產(chǎn)物用EZ-10柱式膠回收試劑盒（Omega，廣州）回收純化，1%瓊脂糖電泳檢測，用分光光度計NanoDrop 2000 （Thermo Scientific）測定濃度后，進(jìn)行pMD 18-T載體（Takara， 大連）在16℃連接4h，5ul反應(yīng)體系為：載體50ng，PCR純化產(chǎn)物20ng， Solution I 1.0ul。連接后的產(chǎn)物與E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞（Takara， 大連）感受態(tài)細(xì)胞按說明書進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)化程序，隨后在平板上做藍(lán)白斑篩選，37℃過夜培養(yǎng)。挑取陽性單克隆在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～5h后對菌液做PCR檢測，反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序見表1。將陽性克隆搖菌，用EZ-200 柱式試劑盒（生工，上海）提取質(zhì)粒，用BigDye v3.1（Applied Biosystems， USA）和ABI3730xl（Applied Biosystems， USA）測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所得測序結(jié)果在軟件GENEIOUS PRO 3.5.6[7]中查看測序峰圖并逐一進(jìn)行人工校對，通過比對去掉載體序列，隨后進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和比對。將比對后的序列經(jīng)格式轉(zhuǎn)換后，在軟件DnaSP 5.1[8]中統(tǒng)計單倍型個數(shù)。從GenBank下載藍(lán)玉簪龍膽的近緣種線葉龍膽的76條ITS克隆數(shù)據(jù)（MN124292-MN124367）與藍(lán)玉簪龍膽現(xiàn)有序列（AY858677），采用最大似然法，在IQ-TREE[9]中基于單倍型構(gòu)建藍(lán)玉簪龍膽和線葉龍膽的系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)樹構(gòu)建采用的核苷酸替換模型由IQ-TREE自動計算。選用Ultrafast方法[10]進(jìn)行bootstrap計算，設(shè)為5000次。以龍膽屬秦艽組的麻花艽（MF579734）、粗莖秦艽（MF506958）為外類群。

2 結(jié)果

2.1 序列特征

本研究對來自3個居群的6個個體進(jìn)行基因克隆與測序，共得到8條ITS序列，長度為644～651bp。其在59個位置存在變異，包含48個堿基突變，11個缺失/插入（表2），共鑒定出7個單倍型（GenBank No. MN128583-MN128589）。在48處堿基突變中，2種堿基間的突變有47處，3種堿基間的突變有1處;缺失/插入的堿基片段長度從1～9bp。在鑒定出的8個單倍型中，僅有1個單倍型在多個克隆中共享，剩余單倍型均為單個克隆特有。共享的1個單倍型分布于6207種群的2個個體中。

2.2 遺傳分化

本研究中，共得到藍(lán)玉簪龍膽8條ITS序列，共鑒定出7個單倍型，表現(xiàn)很高的雜合性。與線葉龍膽76條ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹可分為2個支系，一個支系包括藍(lán)玉簪龍膽的2個單倍型（V_6，V_7），另一個支系為線葉龍膽的全部以及藍(lán)玉簪龍膽剩余的5個單倍型（圖1）。系統(tǒng)樹基部節(jié)點(diǎn)的支持較高，內(nèi)部的支持率大部分均低于60%（圖1中未標(biāo)注部分）。此外，值得注意的是從GenBank上下載的藍(lán)玉簪龍膽ITS序列，其在系統(tǒng)發(fā)育樹中與外類群聚在一起，而并未與該物種及其近緣種線葉龍膽的序列聚成一個大支。

3 總結(jié)

ITS序列是最常用的分子標(biāo)記之一，被廣泛用于系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。由本研究可知，藍(lán)玉簪龍膽ITS序列存在高度雜合性。雖然本研究的樣品有限，但在651bp長度的序列中，仍然存在48個堿基突變和11個缺失/插入。然而，如果不經(jīng)過序列克隆直接進(jìn)行測序，在居群內(nèi)能鑒定出的變異位點(diǎn)非常有限。此外，系統(tǒng)發(fā)育樹重建的結(jié)果表明，不經(jīng)過序列克隆直接測序得到的序列在系統(tǒng)發(fā)育樹中與外類群聚在一起，并未與藍(lán)玉簪龍膽及其近緣種線葉龍膽的克隆序列聚成一個大支，雖然可能是由于樣品產(chǎn)地不同導(dǎo)致的地區(qū)間的遺傳分化，但也從一定程度說明克隆測序得到的序列與直接測序得到的序列在進(jìn)化分析中可能存在結(jié)果不一致的情況。因此，對于ITS序列存在高度雜合的物種，深入的單克隆測序工作是有必要的。

藍(lán)玉簪龍膽與線葉龍膽是2個形態(tài)分化明顯的物種，具有顯著的形態(tài)分化，例如線葉龍膽的蓮座葉叢小或者沒有、莖生葉為線形、花為天藍(lán)色，而藍(lán)玉簪龍膽的蓮座葉叢大、莖生葉為橢圓形、花為深藍(lán)色。然而，用分子片段ITS 難以將這2個物種區(qū)分開，說明2個物種的遺傳分化尚不完全，是近期物種形成的產(chǎn)物，符合龍膽屬在近期快速分化的事實(shí)[2]。雖然藍(lán)玉簪龍膽形成了1個支系，且系統(tǒng)發(fā)育樹基部節(jié)點(diǎn)的支持率較高，但多數(shù)藍(lán)玉簪龍膽的單倍型仍內(nèi)嵌在線葉龍膽支系之中。由于龍膽屬是一個近期快速分化的類群[2]，物種間的遺傳分化較小，給近緣物種的區(qū)分增加了難度，有待用更大數(shù)據(jù)量如二代測序技術(shù)加以區(qū)分。

參考文獻(xiàn)

[1] Ho T N ， Liu S W. A worldwide monograph of Gentiana[M]. Beijing： Science Press， 2001.

[2]Favre A ， Michalak I ， Chen C H ， et al. Out-of-Tibet： the spatio-temporal evolution of Gentiana （Gentianaceae）[J]. J. Biogeogr. 43： 1967-1978.

[3]Sun S S ， Fu P C ， Zhou X J ， et al. The complete plastome sequences of seven species in Gentiana sect. Kudoa （Gentianaceae）： insights into plastid gene loss and molecular evolution[J]. Front. Plant Sci.， 2018， 9： 493.

[4]孫姍姍，付鵬程.龍膽族（龍膽科）分類與進(jìn)化研究進(jìn)展[J]. 西北植物學(xué)報，2019， 39（2）： 0363-0370.

[5]Doyle J J ， Doyle J L.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf material [J]. Phytochemical Bulletin， 1987， 19： 11-15.

[6]Taberlet P . Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA[J]. Plant Mol. Biol， 1991， 17（5）：1105-1109.

[7]Kearse M ， Moir R ， Wilson A ， et al. Geneious Basic： An integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data[J]. Bioinformatics， 2012， 28（12）：1647-1649.

[8]Librado P ， Rozas J . DnaSP v5： a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data[J]. Bioinformatics， 2009， 25（11）：1451-1452.

[9]Nguyen LT ， Schmidt H A ， von Haeseler A ， et al. IQ-TREE： a fast and effective stochastic algorithm for estimating maximum-likelihood phylogenies[J]. Mol. Biol. Evol.， 2015， 32： 268-274.

[10]Minh B Q ， Nguyen M A T ， Von Haeseler A . Ultrafast Approximation for Phylogenetic Bootstrap[J]. Mol. Biol. Evol.， 2013， 30（5）：1188-1195.

作者簡介：

孫姍姍，講師。研究方向：植物適應(yīng)性進(jìn)化。

基金項(xiàng)目：洛陽師范學(xué)院培育基金（項(xiàng)目編號：2018-PYJJ-009）