趙業(yè)輝 丁小玲

摘 ?要：目的主要是在結(jié)合實(shí)際的基礎(chǔ)上促使天麻丸的微生物限度檢查方法得以順利建立。方法將中國(guó)藥典2015年版四部非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查方法作為主要依據(jù)，促使方法適用性試驗(yàn)得以順利開展。結(jié)果其中兩個(gè)企業(yè)在實(shí)際檢查過(guò)程中使用的方法為常規(guī)檢查，其余兩個(gè)企業(yè)主要是借助稀釋法進(jìn)行檢查工作。結(jié)論在消除產(chǎn)品抑菌成分對(duì)微生物檢驗(yàn)的影響方面稀釋法起著不可替代的重要作用。

關(guān)鍵詞：微生物限度檢查;天麻丸;中國(guó)藥典

天麻丸在中成藥品種涵蓋范圍之內(nèi)，其中包含10味中藥材，主要涉及到天麻、羌活、獨(dú)活、地黃等，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行加工可實(shí)現(xiàn)對(duì)成水蜜丸，小蜜丸和大蜜丸的有效煉制，現(xiàn)階段市場(chǎng)內(nèi)一般銷售的品種為水蜜丸以及大蜜丸。加入適當(dāng)?shù)纳幵凼侵谐伤幫鑴┑闹饕a(chǎn)工藝，這也是藥品安全高度重視，微生物的負(fù)載和污染菌的狀況的主要原因。最新版中國(guó)藥典與傳統(tǒng)藥典相比有相當(dāng)大的變化，在實(shí)際試驗(yàn)過(guò)程注意對(duì)其進(jìn)行科學(xué)借鑒。

一、儀器、材料與樣品

1.儀器

Thermo1378生物安全柜;InterScienceS500自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)器;ThermoIGS180培養(yǎng)箱;SanyoMIR254生化培養(yǎng)箱;TomySX-700高壓滅菌器。

2.培養(yǎng)基

大豆酪蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，大豆酪蛋白胨液體培養(yǎng)基，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，腸道菌增菌液體培養(yǎng)基，麥康凱肉湯培養(yǎng)基等都可在這一試驗(yàn)中進(jìn)行使用，注意結(jié)合實(shí)際與試驗(yàn)要求也可科學(xué)選擇，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂，RV沙門菌增菌肉湯培養(yǎng)基，木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂，三糖鐵瓊脂等培養(yǎng)基。

需要注意的是上述培養(yǎng)基的提供單位都為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)。北京三藥科技開發(fā)公司所提供的培養(yǎng)基為沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基。在實(shí)際使用之前我們必須針對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行嚴(yán)格的適用性檢查，檢查結(jié)果符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)與要求的才可以真正投入使用。

3.菌種

金黃色葡萄球菌（S.aureus）[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）[CMCC（B）63501]大腸埃希菌（E.coli）[CMCC（B）44102]白色念珠菌（C.albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（A.niger）[CMCC（F）98003]、乙型副傷寒沙門菌（S.paratyphiB）[CMCC（B）50094]均來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院醫(yī)學(xué)菌種保藏中心，試驗(yàn)菌為第3代菌株。

二、方法與結(jié)果

1.菌液制備

大豆酪蛋白胨液體培養(yǎng)基主要接種對(duì)象為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌，注意將溫度控制在30-35℃范圍之間，培養(yǎng)時(shí)間為18-24h。沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基接種對(duì)象為白色念珠菌接種，需要在20-25℃的范圍之內(nèi)培養(yǎng)2-3d。

黑曲霉主要是在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行接種，其溫度也需要控制在20-25℃之間，但其培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，需要5-7d。在實(shí)際針對(duì)孢子進(jìn)行洗脫工作的過(guò)程當(dāng)中我們需要借助0.05%的聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液。最后將上述菌株制成菌液備用，注意起級(jí)別為稀釋級(jí)，這一過(guò)程中所使用的溶液為0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液。

2.實(shí)驗(yàn)方法

（1）微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)-平皿法

取供試品10g，加大豆酪蛋白胨液體培養(yǎng)基至100mL，勻漿，靜置約5min，取上層液體即為1∶10供試液，取1mL注皿，分別傾注大豆酪蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基及沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，作為供試品對(duì)照組。

另取銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液0.1mL加至9.9mL上述供試液，混勻，使每毫升混合液含菌量不大于100cfu，取上述混合液1mL注入平皿，傾注大豆酪蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，每個(gè)菌株分別制備2個(gè)平板，取白色念珠菌、黑曲霉菌液0.1mL加至9.9mL上述供試液，混勻，使每毫升混合液含菌量不大于100。

（2）微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)———稀釋法

制作供試品對(duì)照組及菌液組，培養(yǎng)，計(jì)數(shù)，計(jì)算回收比值。2.2.3控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)?zāi)湍扄}革蘭陰性菌檢查：按照“2.2.1”方法制備1∶10供試液，置20～25℃培養(yǎng)約2h，取相當(dāng)于供試品0.1、0.01、0.001g的預(yù)培養(yǎng)物分別加至10mL的腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，一式2份，其中1份3管每管中加入不大于100cfu的大腸埃希菌，另1份3管每管中加入不大于100cfu的銅綠假單胞菌，按照藥典規(guī)定方法培養(yǎng)后，每管分別劃線接種到紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上，培養(yǎng)后觀察結(jié)果。

三、討論

考察了4個(gè)廠家5個(gè)品種的天麻丸的微生物限度檢查方法，雖然都是按照中國(guó)藥典2015年版的處方進(jìn)行生產(chǎn)，但其產(chǎn)品對(duì)微生物的檢出有不同程度的干擾現(xiàn)象，部分產(chǎn)品應(yīng)采用稀釋法進(jìn)行檢查，才能順利檢出樣品中可能污染的微生物，究其原因，可能與原藥材產(chǎn)地、炮制方法、不同輔料對(duì)微生物生長(zhǎng)環(huán)境的影響、還有生產(chǎn)工藝有一定的關(guān)系。

說(shuō)明同一品種不同企業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)品不能死搬硬套同一種微生物限度檢查法，而應(yīng)該經(jīng)過(guò)方法適用性確定其可行性;企業(yè)生產(chǎn)的同一個(gè)品種，在原藥材產(chǎn)地、批次、炮制方法以及生產(chǎn)工藝發(fā)生改變的時(shí)候，也應(yīng)該進(jìn)行方法確認(rèn)其檢查方法的可行性;藥檢所對(duì)抽驗(yàn)藥品進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí)，遇到不同企業(yè)的產(chǎn)品，在條件許可的情況下，也應(yīng)盡可能獲取相應(yīng)的檢驗(yàn)方法資料。

關(guān)于稀釋法的操作，本試驗(yàn)中菌落計(jì)數(shù)方法采用了取1∶50供試液1mL注皿的稀釋法（最后5皿合并計(jì)數(shù)），與采用中國(guó)藥典2010年版收載的培養(yǎng)基稀釋法（取1∶10供試液1mL分注5皿，每皿0.2mL），在每皿中的供試液濃度是一樣的，但在方法適用性試驗(yàn)加菌的操作中，提前加到稀釋液中，制成的最終濃度供試液就和菌液混合，更實(shí)際模擬檢驗(yàn)過(guò)程中微生物的生長(zhǎng)環(huán)境特性，而后者是在傾注培養(yǎng)基的時(shí)候供試液才與菌液混合，使抑菌成分對(duì)微生物的作用可能被培養(yǎng)基部分稀釋掩蓋了，過(guò)程試驗(yàn)對(duì)抑菌成分的模擬效果有一定的試驗(yàn)偏差。

結(jié)語(yǔ)

新版藥典與以往版本的藥典相比，計(jì)數(shù)方法限度采用了指數(shù)方式來(lái)表示，引入了可接受的最大菌數(shù)的概念，針對(duì)微生物試驗(yàn)的特性，用數(shù)理統(tǒng)計(jì)的方法，從給藥途徑、藥品特性、使用方法方面對(duì)藥品進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，提高用藥的安全性保障。

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