王昊宇

【摘 要】探討檢測新鮮海螺樣品中單增李斯特菌的雙重PCR快速檢測方法?；趩卧隼钏固鼐鷋lyA基因和李斯特菌屬的16sRNA基因分別合成兩對引物，對影響PCR的主要因素進(jìn)行優(yōu)化，最終確定同時(shí)檢測單增李斯特菌兩個(gè)特異性基因的雙重PCR最佳反應(yīng)體系及條件，該方法對于純培養(yǎng)物的最低檢出限為102CFU/mL，模擬污染海螺樣品的檢測限為8CFU/g。

【關(guān)鍵詞】單增李斯特菌；雙重PCR；海螺樣品

【中圖分類號】R197 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1004-7484（2019）01-0225-02

本工作將單增李斯特菌最重要的毒力因子-編碼溶血素的hlyA基因，與李斯特菌屬16sRNA基因同時(shí)作為單增李斯特菌的檢測指標(biāo)，將雙重PCR方法與選擇性增菌法相結(jié)合，旨在建立一種快速靈敏檢測單增李斯特菌的雙重PCR方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)株由省疾病預(yù)防控制中心提供；大腸桿菌（Escherichia coil）、沙門氏菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、產(chǎn)氣桿菌（Aerobacter aerogenes）和傷寒桿菌（Salmonella typhi）為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

1.1.2 試劑

李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基、單增李斯特菌成套生化鑒定管、胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂（TSA-YE）、李氏增菌肉湯LB1、萘啶酮酸、吖啶黃素 青島高科園海博生物有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA Marker、溶菌酶、蛋白酶K、RNaseA以及PCR相關(guān)試劑 北京天根生化有限公司。

1.1.3 引物序列

根據(jù)文獻(xiàn)[1]以單增李斯特菌hlyA基因和李斯特菌屬的16sRNA基因作為靶基因分別合成兩對特異性引物，所用引物序列見表一，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.1.4 儀器

VersaDoc凝膠成像儀 美國伯樂；PCR擴(kuò)增儀 美國伯樂；JM-250電泳儀 大連捷邁科貿(mào)有限公司；D-37520高速冷凍離心機(jī) 德國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的活化培養(yǎng)

取-80℃、25%甘油凍存的菌種，復(fù)蘇培養(yǎng)后，分別劃線于細(xì)菌培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，連續(xù)活化兩次，將單菌落接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)18h。

1.2.2 細(xì)菌基因組DNA的制備

取1ml菌液按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書步驟進(jìn)行DNA提取，并溶于100 μL TE緩沖液中，于-20℃下保存。

1.2.3 雙重PCR的體系建立及優(yōu)化

雙重PCR擴(kuò)增體系：10×Buffer（Mg2+）5?L 、dNTPs（2.5mmol/L）4?L、兩對10mmol/L的上下游引物各1?L、 DNA模板5?L，Taq酶（2.5U/?L）0.8?L ，用ddH2O補(bǔ)足至50?L。

雙重PCR反應(yīng)條件：采用熱啟動(dòng)。95℃預(yù)變性3min ，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸80s，共30個(gè)循環(huán)，72℃終延伸10min。

在上述反應(yīng)體系和條件下，對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，分別設(shè)定退火溫度為：55℃、55.8℃、57.1℃、58.9℃、61.4℃、63.3℃，通過對電泳結(jié)果的分析，最終確定最佳退火溫度。

1.2.4 雙重PCR特異性及靈敏度檢測

特異性檢測：分別提取單增李斯特標(biāo)準(zhǔn)株、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)氣桿菌及傷寒桿菌模板DNA，在最佳雙重PCR體系及條件下擴(kuò)增，檢測引物特異性。

靈敏度檢測：將過夜培養(yǎng)的單增李斯特菌菌液用無菌的生理鹽水10倍梯度稀釋，使目標(biāo)菌濃度依次為：106CFU/mL 、105CFU/mL 、104CFU/mL 、103CFU/mL 、102CFU/mL 、10CFU/mL。分別提取不同濃度菌液的模板DNA，在最佳雙重PCR體系及條件下擴(kuò)增，確定雙重PCR的檢測靈敏度。

1.2.5 人工污染海螺樣品的制備及檢出限檢測

無菌操作取一只海螺的軟組織及體液（陰性）共12.5g，加入李氏增菌肉湯LB1（含抑菌劑）中，充分搖勻制成均質(zhì)液，用無菌生理鹽水10倍梯度稀釋初始濃度為106CFU/mL的單增李斯特菌菌液，取1mL不同稀釋度的菌液分別加入待檢試樣的均質(zhì)液中，30℃震蕩培養(yǎng)24h，分別取1mL增菌液按照方法1.2.2提取模板DNA，進(jìn)行雙重PCR檢測，確定人工污染海螺樣品的最低檢出限。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同退火溫度下雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果

對雙重PCR的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化（圖一），結(jié)果可見兩條帶在一定溫度范圍內(nèi)均能有效擴(kuò)增， 702bp 條帶在相同退火溫度下的擴(kuò)增效果均較938bp條帶明顯，其中在退火溫度為55.8℃和58.9℃時(shí)，兩特異條帶同時(shí)擴(kuò)增清晰，考慮到降低退火溫度可以提高擴(kuò)增效率，最終選定55.8℃為最佳退火溫度，從而確定雙重PCR最佳反應(yīng)條件。

2.2 特異性及靈敏度檢測結(jié)果

在雙重PCR最佳反應(yīng)體系及條件下，應(yīng)用引物1及引物2對不同細(xì)菌的模板DNA進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增。特異性檢測結(jié)果（圖二）顯示：只有單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)株可擴(kuò)增出938bp和702bp二條帶，而其他6株致病菌除引物二聚體外均未出現(xiàn)任何擴(kuò)增條帶，該雙重PCR特異性良好。

將初始濃度分別為106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL、10CFU/mL的單增李斯特菌菌液的DNA作為雙重PCR反應(yīng)模板，確定雙重PCR檢測純菌液的靈敏度，由圖三可知：兩特異條帶同時(shí)檢出的最低菌液濃度為102CFU/mL，其靈敏度能夠滿足樣品選擇性增菌后的檢測要求。

2.3人工污染海螺樣品的檢出限

單增李斯特菌菌液初始濃度為106CFU/mL，取不同稀釋濃度菌液1mL，污染12.5g海螺陰性樣品，30℃ LB1震蕩培養(yǎng)24h，分別提取增菌液DNA進(jìn)行雙重PCR檢測，檢測結(jié)果如圖四所示，當(dāng)濃度為102CFU/mL的菌液污染海螺樣模板品仍可檢出，經(jīng)計(jì)算，此雙重PCR檢測模擬污染海螺樣品檢出限為8CFU/g。

3 結(jié)論

本工作所采用的檢測水產(chǎn)品中單增李斯特菌的雙重PCR快速方法，菌液靈敏度為102CFU/mL，模擬污染海螺樣品檢出限為8CFU/g，全程檢測時(shí)間包括增菌時(shí)間在內(nèi)僅27小時(shí)，與國標(biāo)方法相比省時(shí)省力且經(jīng)濟(jì)，可快速檢測出實(shí)際樣品中的陽性樣品與疑似陽性樣品，可作為海螺樣品中單增李斯特菌的初步鑒定方法。

參考文獻(xiàn)

[1]王海艷，劉中學(xué)，等.食品中單增李斯特菌PCR檢測方法所用引物的特異性比較[J].檢驗(yàn)檢疫科學(xué)，2007（6）：3-8.（J）