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摘 要：為了提高混菌發(fā)酵菜籽粕產(chǎn)飼用復(fù)合酶的產(chǎn)量，對混菌組合和配比進(jìn)行研究，采用響應(yīng)面法對其發(fā)酵條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：最佳菌種組合及配比為枯草芽孢桿菌、毛霉、酵母菌（1：1：1）;在單因素實驗基礎(chǔ)上，以飼用復(fù)合酶活力為指標(biāo)，進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計，獲得最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度35.6℃，時間68h，接種量為9.62%，該條件下飼用復(fù)合酶的產(chǎn)量達(dá)到5764 U/g，比未優(yōu)化前提高了3.4%。

關(guān)鍵詞：菜籽粕;固態(tài)發(fā)酵;混菌;飼用復(fù)合酶;發(fā)酵條件;優(yōu)化

Abatract：In order to improve the yield of feed compound enzyme from rapeseed meal fermented by mixed bacteria， the combination and proportion of mixed bacteria were studied， and the fermentation conditions were studied by response surface method. The results showed that the best combination and proportion of strains were Bacillus subtilis， Mucor and S.cerevisiae （1：1：1）;The optimal fermentation technology was obtained as following：fermentation temperature 35.6℃， time 68h， inoculation amount 9.62%. Under this condition， the yield of fitted model was 5764U/ g， which increased 3.4% compared with the original conditions.

Key words：rapeseed meal;solid-state fermentation;mixed bacteria;feed compound enzyme;fermentation condition;optimization

菜籽粕是油菜籽經(jīng)預(yù)壓浸出工藝處理后得到的副產(chǎn)物，富含有蛋白質(zhì)、粗纖維等營養(yǎng)組分，Ca2+、Mg2+等礦物質(zhì)，以及維生素B、膽堿等維生素，菜籽粕經(jīng)脫毒處理后是制作牲畜與家禽飼料的主要原料，還可以用于制作食品、化妝品和抗菌素原料[1-3]。飼用復(fù)合酶是一種飼料添加劑，主要由水解酶組成，包括淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、植酸酶、纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶等[4-5]。添加復(fù)合酶能補充動物體內(nèi)源酶的不足，消除飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，釋放營養(yǎng)物質(zhì)，顯著提高飼料的利用率，改善動物的生產(chǎn)性能等[6-7]。

目前國內(nèi)外對菜籽粕研究報道較多，主要集中在脫毒、滅菌條件、以及作為飼料組分等方面[8-9]，對菜籽粕的綜合利用報道較少。本實驗利用混菌固態(tài)發(fā)酵菜籽粕生產(chǎn)飼用復(fù)合酶，并采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化發(fā)酵條件，旨在提高酶產(chǎn)量，進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，利用菜籽粕發(fā)酵生產(chǎn)飼用復(fù)合酶，對擴(kuò)大菜籽粕的應(yīng)用范圍，促進(jìn)其綜合利用有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），毛霉（Mucor），黑曲霉（Aspergillus niger），酵母菌（S.cerevisiae），購于中國微生物菌種保藏中心，由本院生物制藥國家重點實訓(xùn)基地保藏。

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）20%，葡萄糖：2%，瓊脂：2%;牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏;0.3%，蛋白胨：1%，NaCl：0.5%，瓊脂：2%。

發(fā)酵培養(yǎng)基：脫毒菜餅50g，0.1%CaCl2，1.5%NH4Cl，2%K2HPO4，0.2%MgSO4，0.5%MnSO4，1%Tween-80，混勻備用。

CBV-1500A超凈工作臺（上海瑞仰凈化裝備有限公司）;QYC.2102恒溫培養(yǎng)搖床（上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司）;HPS-250生化培養(yǎng)箱（哈爾濱東明醫(yī)療儀器廠）;LDZ4-0.8A離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）;UV-9100紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）;HH.SYH-Ni2-C水浴鍋（北京長源實驗設(shè)備廠）。

1.2 實驗方法

1.2.1 菜籽粕的預(yù)處理

利用乙醇法脫毒[10]，脫除有毒物質(zhì)硫甙等物質(zhì)，達(dá)到脫毒目的。

1.2.2 混菌的選擇

裝50g菜籽粕發(fā)酵培養(yǎng)基于250mL搖瓶中，分別按不同組合和比例接入枯草芽孢桿菌、毛霉、酵母菌、黑曲霉4種菌種，于溫度為36℃、轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分的搖床上發(fā)酵培養(yǎng)3d，測定蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶三種酶的總酶活，以選擇出混菌發(fā)酵的菌種組合。

1.2.3 粗酶液制備

取發(fā)酵產(chǎn)物10g，溶于50mL水中，置于4000r/min的離心機(jī)上離心分離15min，取上清液經(jīng)8層紗布過濾所得澄清液體即為粗酶液。

1.2.4 蛋白酶活力測定

按GB/T23527-2009進(jìn)行[11]。酶活力單位定義：在pH7.0、40℃條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸所需的酶量為1個蛋白酶活力單位（U）。

1.2.5 淀粉酶活力測定

采用DNS法[12]進(jìn)行測定。淀粉酶活力單位定義：在pH5.5、50℃條件下，1min分解淀粉釋放出1μg還原糖所需的酶量為1個蛋白酶活力單位（U）。

1.2.6 纖維素酶活力測定

采用DNS法[13]進(jìn)行測定。纖維素酶活力單位定義：在50℃條件下，在1min內(nèi)酶解生成1μg還原糖的酶量為1U。

1.2.7 飼用復(fù)合酶總活力

其計算公式如下：

飼用復(fù)合酶總活力=蛋白酶活力+淀粉酶活力+纖維素酶活力

1.2.8 單因素實驗設(shè)計

分別以發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、轉(zhuǎn)速、接種量為單因素進(jìn)行實驗，探討各因素對飼用復(fù)合酶總酶活的影響。發(fā)酵溫度分別為32、34、36、38、40℃，發(fā)酵時間分別為24、36、48、60、72h，轉(zhuǎn)速分別為160、180、200、220、240r/min，接種量2%、4%、6%、8%、10%。

1.2.9 響應(yīng)面分析

在單因素實驗基礎(chǔ)上，按Box-Behnken實驗設(shè)計原理，選取溫度、轉(zhuǎn)速、接種量進(jìn)行三因素三水平中心組合實驗，見表1。利用mintab15軟件進(jìn)行分析，確定最佳發(fā)酵條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同混菌組合發(fā)酵結(jié)果

按實驗方法，將供試菌種按1：1比例兩兩組合，或三者組合混菌發(fā)酵72h，測定飼用復(fù)合酶總酶活，得到結(jié)果如表2所示。

從表2結(jié)果可知，在混菌組合中，相對于其他組合來講B+M+S的飼用復(fù)合酶總酶活最高，達(dá)到5594U/g，表現(xiàn)出良好的協(xié)同性。因此最佳組合為枯草芽孢桿菌、毛霉、酵母菌（1：1：1）。

2.2 單因素實驗結(jié)果與分析

2.2.1 發(fā)酵溫度對飼用復(fù)合酶活力的影響

一般來講，微生物發(fā)酵均存在最適發(fā)酵溫度。從圖1結(jié)果來看，發(fā)酵溫度對飼用復(fù)合酶活力存在顯著影響，最適發(fā)酵溫度為36℃，該溫度下飼用復(fù)合酶總酶活為5590U/g。

2.2.2 發(fā)酵時間對飼用復(fù)合酶活力的影響

由圖2可知，在考察的24h～72h發(fā)酵時間內(nèi)，飼用復(fù)合酶活力隨時間的增加而增大，但超過72h后，增速減緩，因此從效益角度來看，發(fā)酵時間選72h為佳。

2.2.3 轉(zhuǎn)速對飼用復(fù)合酶活力的影響

搖床轉(zhuǎn)速主要是影響發(fā)酵中溶解氧，由圖3可以看出，轉(zhuǎn)速對飼用復(fù)合酶活力影響不顯著。當(dāng)轉(zhuǎn)速200r/min時，飼用復(fù)合酶活力最高，為5705U/g，故轉(zhuǎn)速宜選200r/min。

2.2.4 接種量對飼用復(fù)合酶活力的影響

從圖4可知，接種量與中性蛋白酶活力呈正相關(guān)。接種量為8%，飼用復(fù)合酶活力為5713U/g。但當(dāng)接種量>8%后，酶活的增速減緩。適當(dāng)增加接種量，能節(jié)約生產(chǎn)時間，但接種量太大則會增加制備種子液的成本，因此接種量宜選8%。

2.3 響應(yīng)面實驗結(jié)果與分析

選取對影響中性蛋白酶活力較顯著溫度（X1）、時間（X2）、接種量（X3）3個因素作為考察對象，其他因素設(shè)定為最佳水平。采用Minitab15軟件按Box-Behnken方法進(jìn)行3因素3個水平實驗設(shè)計。BBD實驗結(jié)果見表3。

利用Minitab15軟件對表4數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到二次多項回歸模型，解得到最佳條件為：X1=-0.18、X2=-0.33、X3=1.62，換算成實際水平，即：發(fā)酵溫度35.6℃，時間68h，接種量為9.62%，該條件下飼用復(fù)合酶的產(chǎn)量達(dá)到5764 U/g，比原始條件提高了3.4%。

3 結(jié)論

本實驗采用響應(yīng)曲面法研究了混菌發(fā)酵菜籽粕產(chǎn)飼用復(fù)合酶的條件。確定了混菌發(fā)酵菌種為枯草芽孢桿菌、毛霉、酵母菌（1：1：1）;通過單因素實驗確定了各顯著因素及水平，分別為：溫度36℃，時間72h，接種量8.%。在此基礎(chǔ)上運用Box-Behnken設(shè)計，采用Minitab15軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合得到二次多項回歸模式，通過求偏導(dǎo)數(shù)，得到最佳條件為：發(fā)酵溫度35.6℃，時間68h，接種量為9.62%，該條件下飼用復(fù)合酶的產(chǎn)量達(dá)到5764U/g，比原始條件提高了3.4%。

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作者簡介：

溫?fù)碥姡?980- ），男，碩士，副教授，研究方向：微生物發(fā)酵工程。

基金項目：湖南省教育廳科學(xué)研究項目（16C0548）