黃為

摘? ?要：為害高粱的蚜蟲(chóng)主要包括高粱蚜和麥二叉蚜，采用傳統(tǒng)農(nóng)藥抗蚜的方式有諸多副作用，因此通過(guò)抗蚜基因定位來(lái)培育高粱抗蚜品種是最有效的抗蚜方法。通過(guò)構(gòu)建感蚜品種Btx623雜交產(chǎn)生的子二代群體的96個(gè)單株進(jìn)行全基因組SSR引物篩選和鑒定，最終挑選47對(duì)有多態(tài)性的SSR標(biāo)記，構(gòu)建了一張分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜，并通過(guò)IciMapping軟件將基因型與抗蚜表型計(jì)算連鎖關(guān)系。研究結(jié)果表明，在二號(hào)染色體上找到兩個(gè)主效的QTL位點(diǎn)，分別位于S2-6與SSR-15、SSR-15與SSR-16之間，研究成果可以為高粱抗蚜的分子標(biāo)記輔助育種提供理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：高粱;蚜蟲(chóng)基因;QTL;SSR

過(guò)去十余年中，有關(guān)高粱抗蚜基因的研究一直不斷取得突破和進(jìn)展。1982年，徐守珍等人鑒定了500余份國(guó)內(nèi)外種質(zhì)資源的抗蚜性，發(fā)現(xiàn)TAM428與Dubor2高抗高粱蚜。2002年，Katsar等人對(duì)蚜蟲(chóng)抗性的研究發(fā)現(xiàn)至少10個(gè)位點(diǎn)位于8個(gè)連鎖群上，與蚜蟲(chóng)生理型C、E、I和K抗性相關(guān)，抗性位點(diǎn)都來(lái)源于抗性親本TX278。2002年，李玥瑩等人以BTAM428×ICS-12B雜交后代建立的抗感群體為試材，設(shè)計(jì)特異性引物，將RAPD標(biāo)記（隨機(jī)多態(tài)性DNA標(biāo)記）轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記（可對(duì)RAPD標(biāo)記末端測(cè)序）得到了差異擴(kuò)增的結(jié)果，從而為分子標(biāo)記輔助育種提供了可靠的依據(jù)。2013年，王道文通過(guò)構(gòu)建BTx623和HN16雜交產(chǎn)生子四代群體，證明顯性基因RMES1為抗蚜基因，位于6號(hào)染色體上。這些研究均提供了研究基礎(chǔ)，主要比較不同高粱個(gè)體的基因型與表型差異以及定位高粱的抗蚜基因[1]。

1? ?研究方法

1.1? ?研究思路

高粱共有10對(duì)染色體（2n=20），其基因組中含735Mbp。為了在其中尋找抗蚜基因，選擇通過(guò)SSR標(biāo)記（近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)）進(jìn)行QTL定位（數(shù)量性狀座位或者數(shù)量性狀基因座，是控制數(shù)量性狀的基因在基因組中的位置）。在每個(gè)染色體上選擇2～8處標(biāo)記，共47對(duì)有多態(tài)性的SSR標(biāo)記。一共獲取96份不同高粱葉片作為樣本，從中提取DNA模版，通過(guò)跑膠后所得的帶型與表型比對(duì)，選擇與表型一致或相似度最高的標(biāo)記，即可得到與抗蚜基因連鎖最緊密的標(biāo)記，而抗蚜基因必在該區(qū)間中，可計(jì)算重組率大致定位。

1.2? ?試驗(yàn)儀器

剪刀、打樣機(jī)、微量移液器、恒溫箱、離心管、紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)、PCR儀、玻璃板、齒梳、電源、回旋震蕩儀、IciMapping軟件等。

1.3? ?試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料以親本A6235（抗蚜）與BTx623（感蚜）雜交后所得的96株子二代作為試驗(yàn)材料。試驗(yàn)藥品選擇無(wú)菌蒸餾水、乙醇、液氮、CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）、氯仿-異戊醇、異丙醇、mix（含Mg2+、dNTP、DNA聚合酶）、電泳用膠、TBE（Tris硼酸）等。

1.4? ?試驗(yàn)步驟

1.4.1? ?篩選標(biāo)記

（1）篩選片段。選擇277對(duì)引物，將兩親本進(jìn)行PCR、電泳，觀察親本多態(tài)性，篩選可做QTL標(biāo)記的片段。QTL標(biāo)記指的是控制數(shù)量性狀的基因在基因組中的位置。對(duì)QTL的定位必須使用遺傳標(biāo)記，人們通過(guò)尋找遺傳標(biāo)記和感興趣的數(shù)量性狀之間的聯(lián)系，將一個(gè)或多個(gè)QTL定位到位于同一染色體的遺傳標(biāo)記旁。

（2）確定標(biāo)記。根據(jù)帶型對(duì)比，選擇差異最為明顯的標(biāo)記，最終在277對(duì)引物中篩選出47對(duì)作為標(biāo)記。以每處標(biāo)記為1組，共6組，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4.2? ?提取DNA

（1）取葉片。每剪取1片葉片后使用乙醇洗剪刀避免污染，并用液氮保存取下的葉片。

（2）打樣。將葉片與鋼珠放入打樣機(jī)中，以12000r/min共打樣40s。

（3）加入CTAB。用微量移液器向每管樣品中加入CTAB800μL，迅速振動(dòng)。最后將所有樣品置于65℃的恒溫箱中放置60min，以破碎細(xì)胞。

（4）離心。用微量移液器向樣品中加入600μL24∶1的氯仿-異戊醇輕晃，以1000r/min離心10min，最終上層水相溶有DNA。

（5）沉淀。取1.5mL離心管，用微量移液器加入600mL異丙醇，使DNA析出為白色沉淀。在-20℃的環(huán)境下放置10min。

（6）洗沉淀。以10000r/min離心5min去上清液，用微量移液器加入800μL75%乙醇輕晃，以洗沉淀。

（7）風(fēng)干。離心4min倒出乙醇，放入通風(fēng)櫥晾干。

（8）加入100μL無(wú)菌蒸餾水，使用紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)所得DNA濃度。

1.4.3? ?PCR

（1）調(diào)配反應(yīng)體系。向提取的DNA模版中加入水、左右引物與mix。

（2）準(zhǔn)備解鏈。將所有樣品置于PCR儀中，條件為94℃、5min。

（3）徹底解開(kāi)雙鏈。條件為94℃、30s。

（4）退火，結(jié)合引物。條件為55～58℃、30s。

（5）DNA聚合酶延伸（1000bp/min）。條件為72℃、30s。

（6）充分反應(yīng)。條件為72℃、10min。

（7）在16℃環(huán)境下冷卻。

說(shuō)明：第3～5步為1個(gè)循環(huán)，共需循環(huán)32～35次。

1.4.4? ?PAGE（核酸電泳）

（1）組裝模具。將兩塊洗凈的玻璃板拼接在一起，用適量膠封底。

（2）制膠。膠濃度為8%，100mL膠中含52.7mL水、26.6mL30%Acrylamide、20mL5×TBE、0.7mL10%過(guò)硫酸銨、0.065mLTEMED。

（3）注膠。將所制膠倒入玻璃板間，插上齒梳，等待凝固，并在模具架間倒入適量TBE作為緩沖液。

（4）點(diǎn)樣。用微量移液器向取下齒梳后形成的凹槽中滴入PCR后的樣本。

（5）電泳。將正負(fù)極連接上導(dǎo)線，接150V、3h。

（6）染色。取下玻璃板間凝膠后，浸泡在AgNO3溶液中20min，浸泡在NaOH溶液中20min，其間皆置于回旋式震蕩儀上震蕩。

（7）取膠，拍照。

2? ?研究結(jié)果與分析

分子標(biāo)記遺傳圖譜如圖1所示，由IciMapping繪制，為高粱各染色體，其上標(biāo)有所選標(biāo)記;對(duì)得到的波峰數(shù)據(jù)分析，利用IciMapping繪制基因型和表型的連鎖關(guān)系，在log圖中尋找波峰，縱坐標(biāo)LODScore≥2.5時(shí)，即視為該標(biāo)記處存在QTL，抗蚜基因的可能性極高。由以上結(jié)果可知，在二號(hào)染色體上存在LODSCORE明顯高于2.5的QTL2個(gè)波峰。抗蚜基因定位（2號(hào)染色體）如圖2所示，放大二號(hào)染色體標(biāo)記圖分析可知，兩抗蚜基因存在于S2-6與SS-15以及SSR-15與SSR-16之間。

利用QTL定位并比對(duì)基因型與表型的方法，在高粱二號(hào)染色體S2-6與SSR-15、SSR-15和SSR-16之間定位了2處抗蚜基因，從而有效防治蚜蟲(chóng)危害。

參考文獻(xiàn)：

[ 1 ] 劉國(guó)慶，杜瑞恒，侯升林，等.高粱抗蚜研究進(jìn)展[J].植物學(xué)報(bào)，2012，47（2）：171-187.

（收稿日期：2019-11-23）