殷培峰 孫 驍 步顯勇 向玉勇 柴新義 蔡金鑫

1. 滁州學院生物與食品工程學院，安徽 滁州 239000； 2. 安徽盼盼食品有限公司，安徽 滁州 239000

果桑具有高經(jīng)濟價值和開發(fā)潛力，其果實味甜汁多，營養(yǎng)價值豐富，在我國栽植面積不斷擴大，但桑椹菌核病的發(fā)生率也大幅度上升。桑椹菌核發(fā)病原因在于菌核萌發(fā)產(chǎn)生子實體釋放子囊抱子侵染花序，孢子萌發(fā)后在子房內(nèi)大量繁殖，導致桑椹失去食用價值[1]。感病后期，菌絲在各種因素誘導下逐步形成菌核，并以菌核形式在土中越冬，第2年3月下旬至4月上中旬，氣溫在20℃左右，濕度在85%以上菌核繼續(xù)萌發(fā)產(chǎn)生子囊盤，釋放孢子，繼續(xù)為害[2]。桑椹菌核病病原菌多樣，以桑實杯盤菌(Ciboria shiraiana)、肉阜狀杯盤菌(Ciboria carunculoides)、核地杖菌(Scleromitrula shiraiana)為主[3]，核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)，Scleromitrula sp.和Synciboria ningpoensis也被報道對桑花序具有侵染能力，導致桑椹發(fā)病[4-5]。菌核病致病性在其它農(nóng)作物如油菜報道較多，致病菌核盤菌菌絲代謝產(chǎn)生的多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase)和草酸(Oxalic acid)是關(guān)鍵致病因子，另外，果膠酶(Pectinase)、膠質(zhì)酶(Cutinase enzyme)、幾丁質(zhì)酶(Chitinase)和一些胞外酶(Ectoenzyme)等也在致病過程中發(fā)揮了重要作用，但在桑椹菌核病病原菌侵染過程中的主要致病基因報道較少。

現(xiàn)階段，對桑椹菌核病防治主要通過噴灑抗真菌類農(nóng)藥[6]，但易產(chǎn)生農(nóng)藥殘留。為進行生物防治，減少農(nóng)藥使用[7]，探究病原菌致病相關(guān)基因種類及數(shù)量，及這些基因參與過程代謝途徑[8]，是菌核病防治工作研究的重點。高通量測序技術(shù)可從整體水平上獲得所有轉(zhuǎn)錄本的序列信息和表達信息，已經(jīng)被越來越廣泛地應用于各類致病菌的致病機理研究。本研究對小粒性菌核病(mulberry sorosus parvulling sclerote disease)病原菌感病初期轉(zhuǎn)錄組進行測序，并對這些基因進行生物信息學分析，獲得致病基因種類數(shù)量，基因參與主要代謝通路，為通過基因工程對菌核病進行防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

實驗材料為滁州學院果桑種植基地果?！按?0”。人工接種收集的小粒性菌核病孢子，采集第3天發(fā)病病果，用無菌水沖洗，剔除外部桑椹果肉，獲取病原菌菌絲，液氮-80 ℃下速凍保存，在南京普東興生物科技有限公司提取總RNA，進行測序分析。

1.2 樣本表達譜測序及測序樣本信息注釋

以 TRIzol 法提取總RNA，采用Qubit 2.0熒光計進行核酸精確定量，NanoDrop檢測其濃度，富集純化 mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈 cDNA，構(gòu)建測序文庫。使用Ion ProtonTM高通量測序儀測序，采用FastQC軟件對原始測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)控，過濾、去除低質(zhì)量堿基較多的reads和測序接頭[9]。過濾后的reads比對到NR數(shù)據(jù)庫，獲取測序信息。E-value值小于10～5為可信值，獲取reads信息，拼接獲得Unigenes及相對表達水平(RPKM)[10]，并對基因功能進行注釋。

1.3 基因NR數(shù)據(jù)庫比對分析及GO和KEEY分析

利用blast進行NR數(shù)據(jù)庫物種分布比對分析，統(tǒng)計blast結(jié)果中每個能比對上的物種所對應的基因數(shù)目。根據(jù)注釋信息，對基因進行GO注釋，得到每個基因的GO注釋，包括細胞組成、分子功能及生物過程，探討真菌的基因功能特征。使用KEGG數(shù)據(jù)庫對基因進行KEGG注釋，了解基因在生物學上的代謝通路及功能。通過對基因功能進行注釋分析，獲取感病過程中致病基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本測序基本信息

RNA提取結(jié)果顯示，樣本濃度大于200ng/μl的最低要求；NanoDrop檢測OD260/280為2.084，RIN值為1.6，28S:18S值為8.1，所提取的樣本滿足建庫要求。經(jīng)測序獲得reads數(shù)3551251個，對reads進行拼接獲得Unigene14446個，平均長度1093，RPKM值平均75，RPKM值小于5的Unigene數(shù)為11398個：RPKM值介于50～100基因數(shù)量為1556個，大于100基因數(shù)量為1491個，其中有167個Unigene的RPKM值超過1000。將測序結(jié)果與NR數(shù)據(jù)庫blast比對，能比對上的Unigene數(shù)量為14357個，按照物種統(tǒng)計，包含5種真菌，數(shù)目最多的是核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)，其次為富克葡萄孢盤菌(Botryotinia fuckeliana)。其中核盤菌和雪腐大粒菌核病(Sclerotinia borealis)為核盤菌科核盤菌屬真菌，富克葡萄孢盤菌為核盤菌科葡萄孢盤菌屬真菌，杯霉科盤二孢屬楊盤二孢菌(Marssonina brunnea)1個，一種產(chǎn)抗真菌生素相關(guān)絲狀真菌(Glarea lozoyensis)。核盤菌檢測到基因7292個，富克葡萄孢盤菌基因5271個，雪腐大粒菌核病基因738個，楊盤二孢菌基因266個。

表1 Unigene的NR數(shù)據(jù)庫比對分析

2.2 Ungene GO分類

對Unigene進行GO注釋，在細胞組成(cellular component)、基因分子功能(molecular function)、生物過程(Biological process)分別獲得8，4，19個注釋條目(class)。其中Unigene數(shù)量最多的是生物學過程，注釋到的Unigene數(shù)最少的是分子功能。生物學過程包括組織結(jié)構(gòu)形成(Anatomical structure formation)，生物調(diào)節(jié)(Biological regulation)，發(fā)育進程(Developmental process)，定殖(Establishment of localization)，色素淀積(pigmentation)等，分子功能主要包括結(jié)合(binding)，催化(catalytic)，分子結(jié)構(gòu)(structural molecule)和運輸(transporter)。

2.3 Unigenes代謝通路分析

在生物體中，不同基因相互協(xié)調(diào)行使其生物學功能，基于通路的分析，有助于進一步的探索基因的生物學功能及基因調(diào)控機制的研究，KEGG數(shù)據(jù)庫以pathway為單位分析基因代謝通路及功能。通過KEGG注釋，共有1491個Unigenes被注釋，相關(guān)代謝通路有208個，Unigenes數(shù)較多的有代謝通路，次生代謝產(chǎn)物生物合成，微生物代謝和糖酵解等。

表2 KEGG注釋比例最多的前10個代謝通路

2.4 主要致病基因篩選

菌核病在侵染過程中分泌各種酶類及分泌草酸對植物細胞壁及細胞內(nèi)物質(zhì)進行降解，包括纖維素，果膠，幾丁質(zhì)，淀粉，蛋白質(zhì)[11]。通過分析比對，篩選出小粒性菌核病菌絲侵染過程中致病相關(guān)基因，其中cAMP依賴性蛋白激酶(Camp-dependent protein kinase)類4個，多聚半乳糖醛酸酶(Ppolygalacturonase)類6個，幾丁質(zhì)酶(Chitinase)類6個，酸性蛋白(Acid protease)類3個：糖苷酶(Glucosidase)類8個，纖維二糖脫氫酶(Cellobiose dehydrogenase)類3個，膠質(zhì)酶(Cutinase)類4個，漆酶(Laccase)類1個，淀粉酶(Amylase)類4個。同時發(fā)現(xiàn)草酸生成關(guān)鍵基因草酰乙酸乙基水解酶(Oxaloacetate acetylhydrolase)表達。

圖2 核盤菌主要致病基因數(shù)量及占比

3 討 論

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可對樣本進行表達譜序列分析，高效的挖掘轉(zhuǎn)錄本有用信息。本研究通過對侵染期小粒性菌核病菌絲體總轉(zhuǎn)錄本的表達注釋，探明該致病菌的主要致病基因及代謝途徑。發(fā)現(xiàn)小粒性菌核病菌在侵染階段蛋白功能與結(jié)合、催化、分子結(jié)構(gòu)和運輸有關(guān)。富集到代謝通路208個，主要參與生化合成和次生產(chǎn)物代謝等生物學通路。為開展菌核病菌致病基因克隆，基因功能驗證及生物防治提供生物信息學基礎。

核盤菌侵染過程中表達產(chǎn)物多聚半乳糖酸酸酶(Polygalacturonase, PGs)[12]和草酸(Oxalic acid,OA)[13]在核盤菌科真菌的致病過程中起著關(guān)鍵作用。草酸能夠螯合鈣離子來降低果膠聚合物的穩(wěn)定性，從而增加病原菌產(chǎn)生的果膠酶進入寄主的可能性以及寄主對果膠酶的敏感性，草酸還能夠抑制寄主植物的氧爆發(fā)和多酚氧化酶的活性。多聚半乳糖酸酸酶在核盤菌類病原真菌侵染過程中發(fā)揮著定植和致病因子的作用。此外草酸和多聚半乳糖醛酸酶存在著協(xié)同作用，核盤菌在侵染植物時產(chǎn)生的草酸能夠維持較低的pH環(huán)境，有利于包括聚半乳糖酸酸酶在內(nèi)的水解酶活性的發(fā)揮[14]。通過表達譜分析發(fā)現(xiàn)小粒性菌核病菌在侵染過程中多聚半乳糖醛酸酶和生成草酸相關(guān)關(guān)鍵蛋白--草酰乙酸乙基水解酶都有表達，說明小粒性菌核病菌致病過程與其他核盤菌相似。同時也發(fā)現(xiàn)漆酶、蛋白酶、果膠酶、糖苷酶、纖維素酶和淀粉酶等致病因子[15]。在這些酶作用下，可使桑椹子房內(nèi)果膠質(zhì)完全分解，降解細胞壁中的多聚糖結(jié)構(gòu)，迅速消解組織中膠層，引起細胞電解質(zhì)外滲、質(zhì)壁分離和軟腐。以上致病基因表達可使小粒性菌核病菌更容易侵染桑組織器官，導致桑椹腐敗，失去食用價值。

通過GO功能富集分析和代謝通路顯著性分析，發(fā)現(xiàn)小粒性菌核病菌在侵染初期次生代謝產(chǎn)物生物合成，氨基酸生物合成，糖酵解/糖異生途徑等顯著富集，并伴隨細胞定殖，色素沉積等生理過程，研究結(jié)果將為今后進一步探索其侵染分子機制提供基礎資料。