劉長彬，石國慶，盧春霞

(1. 石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832003; 2. 省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室/新疆農(nóng)墾科學院，新疆石河子 832000;3. 長江師范學院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學院，重慶 408100)

0 引 言

【研究意義】妊娠相關糖蛋白 ( Pregnancy-associated glycoproteins，PAG) 是偶蹄類動物胎兒胎盤滋養(yǎng)層細胞合成、分泌的一類糖蛋白。1991年Zoli 等[1]在從奶牛胎盤中分離出得到分子量為67 kDa的糖蛋白，與Butler等[2]發(fā)現(xiàn)的妊娠特異性蛋白 B ( PSPB )有著高度的相似性，構成了一個龐大的胎盤糖蛋白家族，統(tǒng)稱PAG。PAG屬于天冬氨酸蛋白酶家族，與胃蛋白酶、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E有50%以上的相同氨基酸序列，但大多數(shù)PAG由于催化位點氨基酸發(fā)生置換使得其沒有酶活性。牛妊娠相關糖蛋白(bPAG)基因家族至少有 22 個轉錄本以及變異體，由胎盤滋養(yǎng)外胚層細胞和滋養(yǎng)外胚層的雙核細胞表達產(chǎn)生，有些在胚胎附植后進入母體血液[3-5]，且整個孕期持續(xù)存在，常作為一種標志物用于母畜早期妊娠診斷[6-8]?！厩叭搜芯窟M展】基于免疫分析的商品化PAG檢測試劑盒已大規(guī)模推廣應用，并取得較高的診斷準確率[9-10]，但進口試劑盒檢測成本過高(36元/頭)，大多數(shù)牛場望而卻步。而國內關于PAG相關研究報道較少，且無商品化的PAG蛋白和抗體銷售，進而限制了其在國內牧場的推廣應用。因此，獲取高純度PAG蛋白，建立相應的快速檢測方法，是需要迫切解決的問題。目前，已有研究者從多種哺乳動物胎盤胎兒子葉中分離出PAG 天然蛋白[1, 11-12]，但是純化步驟繁瑣復雜，需要多種純化方法同時使用才能獲得高純度的PAG。也有人利用豌豆凝集素[13-14]及胃蛋白酶抑制劑[15-16]等特異性結合PAG，通過親和層析法分離獲得PAG，但該法成本較高，不利于蛋白的大量純化。而體外重組蛋白技術為PAG結構、功能和應用研究提供了新思路，目前已有人在真核系統(tǒng)中表達了bPAG1[17]，但PAG1 在體內的半衰期較長，在母畜產(chǎn)后80～100 d內仍能檢測到，在此時間段內檢測易出現(xiàn)假陽性結果[6, 18]。有研究表明，bPAG9早在牛妊娠后 25 d 就已經(jīng)表達[3]，且在前3個月內轉錄水平顯著高于bPAG1[19]?！颈狙芯壳腥朦c】迄今為止，尚未見到關于bPAG9重組蛋白的研究報道。研究據(jù)宿主細胞對密碼子的偏好性，對bPAG9基因密碼子進行優(yōu)化。【擬解決的關鍵問題】通過PCR方法擴增得到bPAG9的全基因序列，然后構建proEM-bPAG9真核表達載體，在HEK293細胞中誘導表達并產(chǎn)生bPAG9重組蛋白。研究天然bPAG蛋白不易分離純化，為奶牛早期妊娠診斷產(chǎn)品的研發(fā)提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試劑

DH5a菌株、ProEM載體、Ni-IDA 蛋白純化試劑盒、ECL化學發(fā)光試劑盒購自德泰生物科技(南京)有限公司；、T4 DNA 連接酶購自寶生物工程(大連)有限公司；SDS-PAGR變性丙烯酰胺凝膠制備試劑盒、小鼠抗6× His單克隆抗體、蛋白Mark、DNA mark、EcoRI 內切酶 、HindIII 內切酶、丙烯酰胺、脂質體高效轉染試劑、氨芐青霉素等購自生工生物工程(上海)股份有限公司。質粒抽提試劑盒、DNA 瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；BCA蛋白檢測試劑盒上海碧云天生物技術有限公司；ToxinEraserTM 內毒素去除試劑盒購自南京金斯瑞生物科技有限公司；酵母提取物、蛋白胨購自OXOID公司；二甲基亞砜(DMSO)、L-谷氨酰胺購自Sigma公司；哺乳動物細胞培養(yǎng)基 、Opti-MEM、Anti-Clumping-Agent 、Pluronic?F-68等購自Gibco Thermo Fisher公司。

1.1.2 儀器與設備

VeritiTM96梯度PCR儀(美國ABI)；Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD)；Essential V4凝膠成像系統(tǒng)(英國UVITEC)；Powerpac 300電泳儀(美國BIO-RAD)；DYCZ-24EN雙垂直電泳槽(北京六一儀器廠)；DYCP-31BN瓊脂糖水平電泳(北京六一儀器廠)；Thermo311 CO2培養(yǎng)箱(美國熱電公司)；Thermo ScientificTMVarioskan Flash全波長掃描式多功能讀數(shù)儀(美國賽默飛)；KTA Explorer 100 蛋白純化層析系統(tǒng)(美國通用電氣(GE)公司)；倒置生物顯微鏡(上海測維光電技術有限公司)；MicroPulser電轉儀(美國Bio-Rad)；BSC -150 型恒溫恒濕培養(yǎng)箱( 上海博訊事業(yè)有限公司)；優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)(成都超純科技有限公司)；生物安全柜(蘇靜安泰)。

1.2 方 法

1.2.1 bPAG1基因優(yōu)化與合成

根據(jù)根據(jù) Genbank公布的bPAG9(登錄號：AF020511.1)核苷酸序列，以及宿主細胞的對密碼子的偏好性，對bPAG9密碼子進行優(yōu)化，并在優(yōu)化后序列的5’端設計EcoRI位點，3’端設計HindIII酶切位點和His-Flag 標簽，優(yōu)化的序列見3.1。根據(jù)優(yōu)化后的bPAG9核苷酸序列，應用 primer premier軟件設計18條引物(其余引物未列出)，引物1：5’- CCAAGTTTAAACGGATCTCTAGCGAATTCCCGCCGCCACCATGAAGTGGATCGTGCTCCTGGGCCTGGTGGCTTTCAGCGAGTG-3’，引物18：5’-GCCGGCCTCGAGCGGCCGCTAGCAAGCTTATCAGTGGTGGTGATGATGGTGCACGGCTCTAGCCAGTCCGATTCTGTCGTTGCCCCGGT-3’(下劃線分別分為EcoRI和HindIII酶切位點)，然后通過PCR的方法擴增出足夠量的目的產(chǎn)物，bPAG9基因優(yōu)化及合成由德泰生物科技(南京)有限公司完成。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用 DNA 凝膠回收試劑盒回收目的片段。

1.2.2 重組載體ProEM-bPAG9的構建

將回收的PCR產(chǎn)物和ProEM載體用EcoRI和HindIII進行雙酶切。PCR產(chǎn)物酶切體系：純化回收的PAG9片段20 μL，10×FD Buffer 5 μL，EcoRI 2.5 μL (10U/μL)，HindIII 2.5 μL (10U/μL)，ddH2O加至50 μL。ProEM 載體酶切體系：ProEM 載體5 μL，10× FD Buffer 5 μL，EcoRI 2.5 μL (10U/μL)，HindIII 2.5 μL (10U/μL)，ddH2O 加至50 μL，以上體系分別37℃酶切1 h。以上酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用膠回收試劑盒回收。將回收的酶切產(chǎn)物用T4連接酶在22℃連接2 h。連接體系為：PAG9 DNA 4 μL，線性載體3.5 μL，T4DNA連接酶Z〗 1 μL (5U/μL)，10x T4buffer 2 μL，ddH2O 加至20 μL。

1.2.3 ProEM-bPAG9載體轉化、篩選與鑒定

將10 μL連接產(chǎn)物加入到50 μL的DH5a感受態(tài)細胞中，混勻，冰浴 10 min。42℃熱激 45 s，冰浴 5 min。加入LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 搖菌培養(yǎng)30 min。取20 μL菌涂到Amp+/LB 固體培養(yǎng)基平板上，37℃過夜培養(yǎng)。挑取單個菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8 h，然后再按1/500比例接種于200 mL LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16 h。收集菌液，離心、去上清。采用質粒抽提試劑盒提取質粒，以其為模板進行PCR擴增，PCR反應體系：引物1 0.5μL，引物18 0.5 μL，提取質粒 2 μL，TaqDNA聚合酶 0.5 μL (10U/μL) ，10× PCR buffer 10 μL，dNTP 1 μL (10 mM)，ddH2O補齊至50 μL。PCR反應條件：95℃預變性3 min， 95℃變性25 s，62℃退火20 s，72℃延伸40 s，共25個循環(huán)，72℃延伸1 min，4℃保存。將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對提取的質粒進行雙酶切鑒定，酶切體系和條件同ProEM載體。將PCR鑒定與雙酶切鑒定得到的陽性轉化子送德泰生物科技(南京)有限公司測序，經(jīng)測序驗證插入序列正確無誤后，進行質粒大量抽提，保存至-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 重組質粒ProEM -bPAG9的誘導表達

rbPAG9的誘導表達參考Patel的方法[17]，并稍作修改。將HEK293細胞37℃復蘇，轉移至10 mL培養(yǎng)基中，800 r/min離心5 min，去上清，重懸細胞，轉移到培養(yǎng)瓶中，加入新鮮培養(yǎng)基，使其密度達到3×105～4×105cells/mL，活力>95%。然后置于培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2培養(yǎng)2～3 d，密度達到2.0×106cells/mL時進行傳代。轉染前1 d將HEK293細胞懸浮培養(yǎng)，使其接種密度達到1×106cells/mL，將重組質粒取和轉染試劑加入至轉染緩沖液中，混勻后加入到待轉染細胞中，37℃、5% CO2培養(yǎng)4 d，收集細胞培養(yǎng)物，離心，收集上清或細胞。

1.2.5 重組蛋白的純化

收集培養(yǎng)液上清，過0.22 μm濾膜后，上清液在4℃下透析(緩沖液50 mM Tris，150 mM NaCl，pH 8.0)，然后采用Ni-IDA柱純化目的蛋白，采用含不同濃度的咪唑(50、500 mM)洗脫溶液進行梯度洗脫，將上清液、流穿液、洗脫液進行 SDS-PAGE電泳，通過考馬斯亮藍染色檢測純化效果。傳化后的目的蛋白采用BCA試劑盒測其濃度。

1.2.6 重組蛋白的Western blot鑒定

2 結果與分析

2.1 bPAG-9基因 PCR擴增與鑒定

Genbank公布(登錄號：AF020511.1)的bPAG9基因全長為1 311 bp，蛋白編碼區(qū)(coding sequence, CDS)長度為1 140 bp，根據(jù)宿主細胞對密碼子的偏好性，加入酶切位點及保護堿基等，優(yōu)化后的bPAG-9基因序列全長1182 bp，基因序列如下：5’-GAATTCCCGCCGCCACC

ATGAAGTGGA TCGTGCTCCT GGGCCTGGTG GCTTTCAGCG AGTGCATCGT

GAAGATCCCC CTGAGGCAGG TCAAGACCAT GCGGAAGACC CTGAGCGGCA

AGAACATGCT GAAGAACTTC CTGAAGGAGC ACCCCTACAG ACTGAGCCAG

ATCAGCTTCC GGGGCAGCAA TCTGACCATC CACCCCCTGC GGAACATCAT

GAACCTGGTG TACGTGGGCA ACATCACCAT CGGCACCCCT CCTCAGGAGT

TCCAGGTGGT GTTCGACACC GGAAGCAGCG ATCTCTGGGT GCCCAGCTTT

袁安回過頭，紅著眼睛看著他的小伙伴們：“我們繼續(xù)往前走，哪怕是一條龍守在那里，我也要舉著火把往它的嘴巴里走，走過它的咽喉，它的胃，它的腸子，再黑也不會怕。我相信萬花谷，它需要我們，就像我們需要它。現(xiàn)在它就在山洞之外。”

TGCACCATGC CAGCTTGTAG CGCTCCAGTG TGGTTCAGGC AGCTGCAGAG

CAGCACCTTC CAGCCCACCA ACAAGACCTT CACCATCACC TACGGCAGCG

GCTCTATGAA GGGCTTCCTG GCCTACGACA CCGTGAGAAT CGGCGATCTG

GTGTCCACCG ATCAGCCTTT TGGCCTGAGC GTGGTGGAGT ACGGACTGGA

GGGAAGGAAC TACGACGGAG TGCTGGGCCT GAACTACCCT AACATCAGCT

TCAGCGGCGC CATCCCCATC TTCGACAACC TGAAGAACCA GGGCGCCATC

AGCGAGCCAG TGTTCGCCTT CTACCTGAGC AAGAACAAGC AGGAGGGCAG

CGTCGTGATG TTCGGAGGCG TGGACCACCA GTACTACAAG GGCGAGCTGA

ATTGGATCCC CCTGATCGAG GCAGGCGAGT GGAGAGTGCA TATGGACAGG

ATCAGCATGA AGCGGACCGT GATCGCTTGC TCTGACGGTT GCGAGGCTCT

GGTGCACACA GGAACAAGCC ACATTGAGGG CCCAGGCAGA CTGGTGAACA

ACATCCACCG GCTGATCAGG ACCAGGCCCT TCGACAGCAA GCACTACGTG

TCTTGCTTCG CCACCAAGTA CCTGCCCAGC ATCACCTTCA TCATCAACGG

CATCAAGTAC CCCATGACCG CCAGGGCCTA CATCTTCAAG GACAGCAGAG

GCAGGTGCTA CAGCGCTTTC AAGGAGAACA CCGTGCGGAC CAGCAGAGAG

ACTTGGATCC TGGGAGACGC CTTCCTGAGG CGCTATTTCA GCGTGTTCGA

CCGGGGCAAC GACAGAATCG GACTGGCTAG AGCCGTGCACCATCATCACCACCAC

TGATAAGCTT- 3’。

下劃線分別分為EcoRI 和HindIII酶切位點，5’端斜體為保護堿基序列，3’端斜體為His-Flag標簽位點。圖1電泳結果表明，PCR成功擴增出帶有酶切位點的目的基因bPAG9，片段大小約1 182 bp，與理論大小基本相符。 圖1

圖1 bPAG9優(yōu)化后全基因PCR擴增電泳圖
Fig. 1 The electropherogram of PCR products of bPAG9 gene

2.2 重組質粒ProEM-bPAG9的構建及鑒定

重組載體轉化后，隨機挑選2個單菌落進行PCR 鑒定，電泳結果顯示(圖2a)，泳道 1～2出現(xiàn)與預期大小相同的目的條帶，表明重組質粒成功轉化到感受態(tài)細胞DH5a。對重組質粒進行雙酶切(圖2b)，泳道1為重組質粒(5 545 bp)，從上至下分別為重組質粒的環(huán)狀、線性和超螺旋三種狀態(tài)，泳道2在為酶切后的ProEM載體和bPAG9基因 ，酶切后的長度分別為4 369 bp和1 176 bp，與預期結果相符，且酶切條帶單一，表明重組載體構建成功。將測序結果與優(yōu)化后的bPAG9基因對比分析，堿基序列完全一致，符合率為100%，其編碼的氨基酸與Genbank (protein ID：AAC04682.1) 公布的完全一致，表明bPAG9插入片段完全正確，未發(fā)生任何堿基突變。圖2

2.3 重組蛋白的表達純化

重組表達載體上帶有6× His標簽，將誘導表達的HEK293細胞上清經(jīng)Ni-IDA純化試劑盒進行親和層析，隨后利用SDS-PAGE對純化的蛋白進行檢測，結果顯示(圖3)，500 mM的咪唑洗脫溶液可獲得純度較高的bPAG9重組蛋白，其相對分子質量約68 kDa，與天然蛋白分子量基本一致[1]。純化后的rbPAG9經(jīng)SDS-PAGE和Gel-Pro Analyzer灰度分析(圖4a～b)， rbPAG9純度達90%。經(jīng)BCA方法檢測，rbPAG9的OD562值為0.273，代入標準曲線 (圖5)，純化rbPAG9濃度為 0.134 mg/mL。圖3～5

a: M, DNA Marker; 1-2, 陽性克隆. b: M, DNA Marker; 1, 重組質粒; 2, 雙酶切片段

a: M, DNA Marker; 1-2; cloning products. b: M,DNA Marker; 1, recombinant plasmid; 2, enzymatic digestion fragment

圖2 陽性克隆(a)及重組質粒雙酶切(b)鑒定結果
Fig. 2 Identification of cloning products (a) and recombinant plasmid (b) by enzymatic digestion

2.4 重組蛋白的Western blot鑒定

純化的rbPAG9重組蛋白C 端包含一個His 標簽，根據(jù)這一特性，利用 His標簽抗體對bPAG9重組蛋白進行Western blot檢測。在約 68 kDa 處有特異性雜交條帶(圖6)，與SDS-PAGE結果一致，說明該重組蛋白在真核表達系統(tǒng)中誘導表達成功。圖6

M：蛋白質分子質量標準，1：上清液，2：流出液，3～5：50 mM咪唑洗脫組分，6～7：500 mM咪唑洗脫組分，泳道上樣量10 μL

M: Protein Marker, 1: Supernate, 2: Effluent, 3-5: Eluent of 50 mM imidazole, 6-7: Eluent of 500 mM imidazole, sampling amount: 10 μL

圖3 SDS-PAGE分析rbPAG9純化效果
Fig. 3 SDS-PAGE analysis of rbPAG9

M：蛋白Marker；1：BSA (1.0 μg)；2：bPAG9 重組蛋白 (0.5 μg)

M: Protein Marker; 1: BSA (1.0 μg), 2: rbPAG9 (0.5 μg)

圖4 SDS-PAGE(a)和Gel-Pro Analyzer灰度分析(b)rbPAG9純度
Fig. 4 The purity analysis of rbPAG9 by SDS-PAGE (a) and Gel-Pro Analyzer (b)

3 討 論

牛妊娠相關糖蛋白 (bPAG) 種類繁多，人們利用RT-PCR技術從牛胎盤組織中篩選出了至少22種 PAG cDNA轉錄本，根據(jù)其出現(xiàn)的時間，將其分為兩組：“古代組”與“現(xiàn)代組”，“古代組”PAG出現(xiàn)在8 000萬年前，經(jīng)過進化在約5 000萬年前出現(xiàn)“現(xiàn)代組”PAG[4]。 大多數(shù) bPAG如bPAG-1、3、4、5、6、7、9、14、15、16、17、18、19、20、21、22屬于“現(xiàn)代組”，由胎盤滋養(yǎng)外胚層的雙核細胞表達產(chǎn)生，由于催化中心堿基發(fā)生了突變而不具有酶活性；而bPAG-2、8、10、11、12、13基因屬于“古代組”，在整個滋養(yǎng)外胚層細胞中產(chǎn)生，保留了典型天冬氨酸肽酶的所有特征，具有酶活性[3, 5, 20]。由于bPAG家庭成員間的序列差異，bPAG基因在整個妊娠期的表達和分泌呈現(xiàn)時空特異性[3, 5, 19-21]，如Green運用核糖核酸酶保護實驗檢測胎盤中RNA的表達，發(fā)現(xiàn)bPAG-2、4、5、8、9、10、11 早在妊娠后 25 d 就已經(jīng)表達，而bPAG-1、6、7在妊娠后 45 d開始表達，主要存在于妊娠中后期[3]。其中，bPAG9在妊娠前三個月內表達水平顯著高于bPAG1[19]。因此，bPAG9可作為一個更理想的標志物用于牛早期妊娠診斷。

圖5 BCA方法標準曲線
Fig. 5 The standard curve of BCA method

由于bPAGs 蛋白種類繁多，增加了對其結構和功能研究的難度，體外重組蛋白的出現(xiàn)為探究一類蛋白的結構和功能提供了新思路。研究采用基因優(yōu)化和PCR體外擴增獲得bPAG9目的基因，并將其成功插入到真核表達載體proEM中，采用HEK293細胞經(jīng)瞬時表達得到相對分子質量約68 k Da的重組蛋白。bPAG9原始基因CDS長度為1 140 bp，包含9個外顯子和8個內含子，編碼379個氨基酸殘基(amino acid, AA)，信號肽別區(qū)域位于第1～15位氨基酸殘基，蛋白質理論分子量為 42.856 kDa，等電點8.82。而天然的bPAG蛋白分子量約為67 kDa[1, 22]。研究所得bPAG9重組蛋白的表觀分子質量與天然蛋白基本一致，但大于bPAG9蛋白的理論分子量，可能rbPAG9在真核表達過程中存在糖基化修飾，因為有研究表明bPAG的氨基酸序列存在N-糖基化位點，導致其在翻譯修飾后分子量增加[23]。

M：蛋白質分子質量標準，1：純化后的rbPAG9(0.5μg)

M: Protein Marker, 1 : Purified rbPAG9 (0.5μg)

圖6 rbPAG9的 Western blot鑒定
Fig. 6 Western blotting analysis of rbPAG9

4 結 論

研究通過基因優(yōu)化和PCR法擴增得到全長1 182 bp的bPAG9全基因序列，以ProEM為真核表達載體成功構建了重組質粒ProEM-bPAG9，雙酶切后獲得與預期值相符的兩條片段(4 369 bp和1 176 bp)，將重組質粒轉入HEK293細胞進行瞬時表達，經(jīng)過Ni柱親和層析，在含有500 mM的咪唑溶液條件下洗脫，獲得相對分子質量約為68 kDa的bPAG9重組蛋白，rbPAG9純度可達90%。研究獲得的bPAG9重組蛋白為其單克隆抗體的制備和奶牛早期妊娠診斷產(chǎn)品的研發(fā)奠定了基礎。