劉曉丹，王 霞，楊祥波，葉 飛

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院，吉林 吉林 132101）

農(nóng)作物廢棄秸稈中含有大量難以被利用的木質(zhì)素資源，同時(shí)木質(zhì)素也是影響反芻動(dòng)物瘤胃微生物消化的因素之一[1]。因此，如何提高微生物對(duì)木質(zhì)素的降解效率成為近年來研究開發(fā)的熱點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，木質(zhì)素降解能力較強(qiáng)的微生物多為白腐真菌、軟腐真菌和褐腐真菌[2-4]。此類真菌通過合成漆酶（laccase，Lac）、錳過氧化酶 （manganese peroxidase，MnP） 和木質(zhì)素過氧化物酶 （lignin peroxidase，LiP）[3，5]等一系列同功酶的方式發(fā)揮作用。

靈芝不僅具有較高的藥理活性，還具有高效降解木質(zhì)素的潛在特性[6]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)靈芝屬的研究多集中在木質(zhì)素降解酶系及單一酶發(fā)酵條件的分析方面，而關(guān)于木質(zhì)素降解應(yīng)用的研究相對(duì)較少。在前期分離到的1株樹舌靈芝（Ganoderma applanatum） 的基礎(chǔ)上，分析該菌株的降解酶系，進(jìn)一步研究其對(duì)木質(zhì)素的降解條件，為提高微生物對(duì)木質(zhì)素的降解能力提供參考，同時(shí)對(duì)未來如何應(yīng)用農(nóng)作物廢棄物資源進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化或飼料加工等領(lǐng)域的研究具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

樹舌靈芝菌株由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基及種子培養(yǎng)基配方參考文獻(xiàn)[7]。

愈創(chuàng)木酚顯色培養(yǎng)基：含0.04%愈創(chuàng)木酚的PDA培養(yǎng)基。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基[8]：小麥麩皮20.0 g·L-1、豆粕2.0 g·L-1、葡萄糖 20.0 g·L-1、KH2PO43.0 g·L-1、MgSO41.5 g·L-1。

木質(zhì)素降解培養(yǎng)基[3]：木質(zhì)磺酸鈉2.0 g·L-1、葡萄糖 0.5 g·L-1、豆粕 2.0 g·L-1、KH2PO43.0 g·L-1、MgSO41.5 g·L-1、CuSO40.375 g·L-1。

1.2 方法

1.2.1 樹舌靈芝降解木質(zhì)素的定性分析

將活化后的樹舌靈芝菌株接種于愈創(chuàng)木酚顯色培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)，12 h后觀察是否形成有色圈，測(cè)定菌落直徑d1及有色圈直徑d2，計(jì)算d1/d2的比值[9]，初步分析樹舌靈芝降解木質(zhì)素的特性。

1.2.2 樹舌靈芝中木質(zhì)素降解酶的動(dòng)態(tài)分析

將活化好的菌株，用打孔器取3塊直徑為5 mm的菌餅，接種至種子培養(yǎng)基中，28℃、120 r·min-1培養(yǎng)5 d后即為種子液，轉(zhuǎn)接至產(chǎn)酶培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。每隔2 d取5 mL發(fā)酵液，10 000 r·min-1離心8 min，取上清液測(cè)定酶活。

木質(zhì)素降解酶系的酶活測(cè)定：漆酶的活性測(cè)定采用ABTS法[10]；錳過氧化物酶（MnP） 的活性測(cè)定參考Rogalski[11]的方法；木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）的活性測(cè)定采用藜蘆醇法[12]。

1.2.3 木質(zhì)素降解率的測(cè)定

配制不同濃度梯度的木質(zhì)磺酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，于280 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[3]。木質(zhì)磺酸鈉濃度與吸光值間的線性回歸方程為y=0.028 8x-0.028 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 6。

種子液按2%接種于降解培養(yǎng)基中，28℃、120 r·min-1培養(yǎng) 9 d。發(fā)酵液經(jīng) 10 000 r·min-1離心 8 min，上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋后，測(cè)定OD280值，計(jì)算木質(zhì)磺酸鈉含量[13]。

木質(zhì)素降解率（P1，%）計(jì)算公式為：

式中：P1表示木質(zhì)素磺酸鈉降解率，C表示發(fā)酵后木質(zhì)素磺酸鈉的含量。

1.2.4 不同因素對(duì)樹舌靈芝降解木質(zhì)素的影響

將制備的種子液接種到降解培養(yǎng)基中，以木質(zhì)素磺酸鈣為底物，發(fā)酵培養(yǎng)9 d后，測(cè)定木質(zhì)素的降解率。以降解率為指標(biāo)，分別考察降解培養(yǎng)基中不同氮源、氮源濃度、底物濃度、培養(yǎng)溫度及初始pH對(duì)樹舌靈芝降解木質(zhì)素的影響。

1.2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化降解條件

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)行 L9(34)正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化木質(zhì)素降解條件。水平因素見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Design of orthogonal test

1.2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照正交試驗(yàn)優(yōu)化的最適降解條件進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)行平行3次試驗(yàn)，計(jì)算木質(zhì)磺酸鈉的平均降解率。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)漆酶樹舌靈芝的定性分析

樹舌靈芝在愈創(chuàng)木酚平板中的顯色分析見圖1。

圖1 樹舌靈芝在愈創(chuàng)木酚平板中的顯色分析Fig.1 Colorimetric analysis of Ganoderma applanatum on plates supplemented with guaiacol

樹舌靈芝菌餅接種于顯色培養(yǎng)基上，第2天即形成淡紅色有色圈，初步判斷該菌株可以產(chǎn)漆酶。第5天后菌落直徑達(dá)到最大，有色圈顏色明顯加深，呈棕紅色。進(jìn)一步測(cè)定菌落直徑和有色圈直徑并計(jì)算d1/d2的比值，比值為 0.568～0.734，小于1.000時(shí)，初步判定該菌株可以選擇性降解木質(zhì)素[14]。

2.2 樹舌靈芝中木質(zhì)素降解酶系的動(dòng)態(tài)分析

對(duì)木質(zhì)素降解酶的測(cè)定結(jié)果如圖2所示。

圖2 樹舌靈芝木質(zhì)素降解酶系分析Fig.2 Ligninolytic enzymes analysis of Ganoderma applanatum

由圖2可知，樹舌靈芝Lac酶活明顯高于LiP和MnP；發(fā)酵培養(yǎng)7 d時(shí)Lac酶活達(dá)到峰值，為735.2 U·L-1。其次是LiP，而MnP的活性相對(duì)較低。LiP和MnP酶活均在第5天檢測(cè)到峰值，分別為254.6 U·L-1和142.7 U·L-1。由此推斷樹舌靈芝木質(zhì)素降解過程中漆酶可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2.3 不同因素對(duì)樹舌靈芝木質(zhì)素降解率的影響

2.3.1 不同氮源對(duì)樹舌靈芝木質(zhì)素降解率的影響

本研究分別選取無(wú)機(jī)氮源和有機(jī)氮源各3種，分析氮源對(duì)木質(zhì)素降解率的影響。結(jié)果如圖3所示。

圖3 氮源種類對(duì)樹舌靈芝木質(zhì)素降解率的影響Fig.3 Effect of nitrogen source species on lignin degradation rate of Ganoderma applanatum

由圖3可知，以豆粕作為氮源時(shí)，木質(zhì)素降解率達(dá)到32.22%，降解效果最好。后續(xù)試驗(yàn)中選擇豆粕為主要氮源。

2.3.2 不同氮源濃度對(duì)樹舌靈芝木質(zhì)素降解率的影響

適宜的氮源濃度有利于提高木質(zhì)素降解率，對(duì)不同氮源濃度的試驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 氮源濃度對(duì)樹舌靈芝木質(zhì)素降解率的影響Fig.4 Effect of nitrogen source concentration on lignin degradation rate of Ganoderma applanatum

由圖4可知，氮源濃度為2.5 g·L-1時(shí)，木質(zhì)素降解率最高。氮源濃度較高時(shí)，木質(zhì)素降解率略低于氮源濃度較低時(shí)的降解率。

2.3.3 不同底物濃度對(duì)樹舌靈芝木質(zhì)素降解率的影響

不同底物濃度對(duì)樹舌靈芝木質(zhì)素降解率影響的試驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖5 底物濃度對(duì)樹舌靈芝木質(zhì)素降解率的影響Fig.5 Effect of substrate concentration on lignin degradation rate of Ganoderma applanatum

由圖5可知，當(dāng)?shù)孜餄舛葹? g·L-1時(shí)，降解效果最好，木質(zhì)素降解率達(dá)到35.73%。當(dāng)?shù)孜餄舛却笥? g·L-1后，降解率迅速下降。分析原因可能是底物濃度升高后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液逐漸粘稠，會(huì)降低菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)及氧氣的吸收[15]，進(jìn)一步抑制菌體分泌降解酶系，進(jìn)而影響木質(zhì)素的降解。

2.3.4 不同培養(yǎng)溫度對(duì)樹舌靈芝木質(zhì)素降解率的影響

不同培養(yǎng)溫度對(duì)樹舌靈芝木質(zhì)素降解率的影響試驗(yàn)結(jié)果見圖6。

圖6 培養(yǎng)溫度對(duì)樹舌靈芝木質(zhì)素降解率的影響Fig.6 Effect of culture temperature on lignin degradation rate of Ganoderma applanatum

由圖6可知，溫度一方面影響菌株的生長(zhǎng)代謝，另一方面影響木質(zhì)素降解速度。在30℃條件下，樹舌靈芝木質(zhì)素降解率最高。溫度高于30℃時(shí)，木質(zhì)素降解率顯著降低，與相對(duì)高溫下降解酶容易變性、失活有關(guān)。

2.3.5 不同初始pH對(duì)樹舌靈芝木質(zhì)素降解率的影響

不同初始pH對(duì)樹舌靈芝木質(zhì)素降解率的影響試驗(yàn)結(jié)果見圖7。

圖7 初始pH對(duì)樹舌靈芝木質(zhì)素降解率的影響Fig.7 Effect of initial pH on lignin degradation rate of Ganoderma applanatum

由圖7可知，該菌株在pH 6.0～9.0之間，對(duì)木質(zhì)素均有很好的降解效果。在pH為9.0時(shí)，木質(zhì)素降解率仍能達(dá)到18.92%。pH過高或過低時(shí)，木質(zhì)素降解率均明顯降低。

2.4 樹舌靈芝木質(zhì)素降解條件的優(yōu)化

樹舌靈芝木質(zhì)素降解條件的優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Orthogonal test results

由表2可知，樹舌靈芝降解木質(zhì)素的最適發(fā)酵條件為氮源濃度2.5 g·L-1，底物濃度3.0 g·L-1，初始pH 6.0，發(fā)酵溫度28℃。極差分析結(jié)果表明，4個(gè)因素對(duì)木質(zhì)素降解率的影響大小依次為氮源濃度＞底物濃度＞初始pH＞培養(yǎng)溫度。各因素對(duì)試驗(yàn)顯著性的影響如表3所示。

由表3可知，氮源濃度對(duì)木質(zhì)素降解率的影響顯著 （P＜0.05）。

表3 正交試驗(yàn)顯著性分析結(jié)果Tab.3 Significance analysis results of orthogonal test

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，選擇最優(yōu)降解條件，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到優(yōu)化條件下樹舌靈芝木質(zhì)素平均降解率，結(jié)果見表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Verification test results

由表4可知，樹舌靈芝木質(zhì)素降解率的平均值為44.72%，表明該發(fā)酵條件下木質(zhì)素降解率較高，重復(fù)性好，符合最佳降解條件。

3 討論

靈芝屬菌類普遍具有高效降解木質(zhì)纖維素的特性，在農(nóng)作物秸稈的生物降解、造紙廢水的處理、飼料加工等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[6]。目前靈芝屬菌類的研究主要包括高產(chǎn)菌株的選育、產(chǎn)漆酶條件的優(yōu)化及酶生物學(xué)特性分析等基礎(chǔ)研究[16]，應(yīng)用研究中多集中在染料脫色方面，關(guān)于木質(zhì)素降解的應(yīng)用研究相對(duì)較少。

真菌在不同生長(zhǎng)階段分泌的木質(zhì)素降解酶活性不同[17]，有文獻(xiàn)報(bào)道[18]食用菌在菌絲體時(shí)期漆酶活性較高，因此本研究采用液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)菌絲進(jìn)行降解特性的分析。不同靈芝菌株的木質(zhì)素降解酶活性差異很大，直接影響到木質(zhì)素的降解率。本研究中對(duì)樹舌靈芝發(fā)酵培養(yǎng)分泌的木質(zhì)素降解酶系分析表明，Lac酶活性明顯高于LiP和MnP；發(fā)酵培養(yǎng)7 d檢測(cè)到峰值，為735.2 U·L-1。劉禹等[19]分析了相同培養(yǎng)條件下，靈芝屬7個(gè)不同菌種漆酶活性間存在差異，其中有柄樹舌與信州靈芝的漆酶活性顯著高于其他菌種，有柄樹舌在第3天時(shí)即可檢測(cè)到高漆酶活性，信州靈芝在第6天達(dá)酶活峰值。王茂成等[20]對(duì)8種不同食用菌產(chǎn)酶情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)木耳和靈芝產(chǎn)酶活性最高，培養(yǎng)到第3天時(shí)，檢測(cè)到靈芝中Lac、LiP和MnP的酶活分別為508.6 U·L-1、112.3 U·L-1和 112.6 U·L-1。

影響菌株合成和分泌木質(zhì)素降解酶種類和活性的關(guān)鍵因素是培養(yǎng)體系中的碳源、氮源的種類、濃度[17]及培養(yǎng)條件。陶君等[21]研究發(fā)現(xiàn)，靈芝的最適產(chǎn)漆酶條件為麥芽糖3%、酵母浸粉0.25%、pH 6.0、培養(yǎng)溫度25℃。潘志恒等[8]發(fā)現(xiàn)，樹舌靈芝發(fā)酵產(chǎn)漆酶最佳培養(yǎng)基為小麥麩皮20 g·L-1、豆粕2 g·L-1、硫酸銅 0.625 g·L-1、香蘭素 0.037 5 g·L-1。孫海鑫[22]研究發(fā)現(xiàn)，雜色云芝產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基最優(yōu)組合為馬鈴薯 200 g·L-1、葡萄糖 10 g·L-1、麩皮 10 g·L-1、黃豆粉7 g·L-1。吳佳慧[23]研究表明，最適合靈芝K-17菌株產(chǎn)漆酶的營(yíng)養(yǎng)成分為玉米粉、麩皮和花生殼。而Stajic等[24]研究表明，靈芝產(chǎn)LiP和MnP的最佳氮源是蛋白胨，Lac和MnP的最佳氮源NH4NO3。Batool等[25]對(duì)靈芝菌株IBL-05進(jìn)行產(chǎn)酶條件的優(yōu)化時(shí)發(fā)現(xiàn)，選擇葡萄糖和尿素作為碳源、氮源，發(fā)酵培養(yǎng)6 d時(shí)，LiP酶活最高。王書超等[26]在對(duì)樹舌靈芝產(chǎn)漆酶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化和分析其主要降解酶系的基礎(chǔ)上，在木質(zhì)素降解特性試驗(yàn)中選擇以豆粕2.0 g·L-1作為氮源，額外添加0.5 g·L-1葡萄糖補(bǔ)充碳源，以滿足菌絲體生長(zhǎng)的需要。

本研究中，在驗(yàn)證樹舌靈芝能夠選擇性降解木質(zhì)素的基礎(chǔ)上，采用液態(tài)發(fā)酵對(duì)樹舌靈芝的降解酶系進(jìn)行分析，并通過正交試驗(yàn)確定了液態(tài)發(fā)酵條件下樹舌靈芝降解木質(zhì)素的最佳條件。目前課題組正在開展樹舌靈芝降解玉米和水稻秸稈的研究，以期為將來樹舌靈芝在農(nóng)作物秸稈資源的生物轉(zhuǎn)化及飼料加工生產(chǎn)等方面的應(yīng)用提供參考資料。