方素芳 張宏英 黃明翔

近年來，在全球范圍內隨著HIV感染、器官移植、糖皮質激素和免疫抑制劑等應用的增加，隱球菌病(cryptococcosis)的感染率、發(fā)病率、致死率均呈明顯升高趨勢[1-2]，對該病的診斷與治療轉歸已成為臨床重點關注的問題。

目前，診斷隱球菌病的主要方法為血清隱球菌莢膜抗原(CrAg)檢測[3-4]，而其中的膠體金免疫層析技術(lateral flow assay，LFA)，因其較高的敏感度和特異度、操作簡單、費用低廉等特點[5-6]，已成為臨床醫(yī)生檢測血清CrAg的首選方法。但目前檢測血清CrAg的研究主要針對HIV感染者，并認為HIV感染者的CrAg檢測敏感度明顯高于非HIV感染者，而將其用于非HIV感染者和肺隱球菌病治療轉歸的研究均較少，且僅為治療前、后或停藥前某個時間點的數(shù)據(jù)說明，或僅以個別患者整個治療過程中的隨訪評價得出結論，對臨床非HIV感染者及療效評估參考意義不大，更未見按照整個治療過程時間軸進行隨訪的研究報道。本課題闡述非HIV感染者利用LFA檢測CrAg對肺隱球菌病的診斷意義、影響因素及治療后抗原動態(tài)變化，而本研究按照隨訪時間軸分析非HIV感染肺隱球菌病患者抗真菌治療后LFA檢測血清CrAg多個時間點的動態(tài)變化情況，評估血清CrAg水平變化能否作為肺隱球菌病患者療效及停藥的一項輔助指標，為臨床診治提供參考。

對象和方法

1.研究對象：選擇2017年3—9月就診于福建省福州肺科醫(yī)院經HIV檢測、病理活檢、真菌培養(yǎng)等明確診斷[7]的非HIV感染的肺隱球菌病患者33例，納入LFA檢測血清CrAg陽性、自愿簽署知情同意書、同意在我院接受規(guī)范治療及定期隨訪的27例患者，其中男17例，女10例；年齡18～70歲，平均(47.4±8.3)歲。4例為體檢時胸部CT檢查發(fā)現(xiàn)肺部病灶，23例因臨床癥狀行胸部CT檢查而發(fā)現(xiàn)，其中咳嗽22例、咳痰20例、氣喘7例、胸痛2例、發(fā)熱2例、乏力1例；27例患者治療前胸部CT表現(xiàn)均為單發(fā)或多發(fā)肺部孤立結節(jié)或腫塊，斑片狀實變浸潤影，混合病變，伴隨空洞征、支氣管充氣征、磨玻璃樣影等改變。25例經病理組織學檢查確診，2例經支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)出新型隱球菌確診。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(批件編號：2017-005-01)并開展實施。

2.觀察指標：收集抗真菌治療前、后時間點LFA檢測血清CrAg的定性及半定量測定、臨床癥狀、胸部CT掃描等資料。收集時間點：開始治療前的27～33 d、治療后的27～33 d，以及治療后的3、6、9、12、15、18個月的前后7 d內。LFA檢測的動態(tài)監(jiān)測標準：若患者在以上任一時間點定性檢測結果為陰性即判定為CrAg陰轉，無需再行半定量滴度測定及后續(xù)監(jiān)測；若未陰轉則繼續(xù)監(jiān)測。

3.LFA檢測血清CrAg抗原：試劑購置于美國Immuno-Mycologies有限公司。常規(guī)無菌操作抽取靜脈血約4 ml于無菌干燥采血管中，3000×g離心10 min取血清。(1)定性檢測：將40 μl(1滴)樣本稀釋液(甘氨酸緩沖鹽溶液，含有封閉劑和防腐劑)加入到無菌試管中，加入離心后的血清40 μl進行混合，將隱球菌抗原檢測試紙條檢測端插入混合樣本液中，10 min后讀取結果。結果判讀：檢測條帶和對照條帶同時出現(xiàn)為陽性；僅出現(xiàn)對照條帶為陰性；若對照條帶未出現(xiàn)，說明檢測無效，應重新檢測。(2)半定量滴度檢測：取10個微離心管或試管放于試管架上，以1∶5作為初始稀釋濃度，依次1∶2、1∶4、1∶16，直至稀釋至1∶2560，并標號1～10。向1號試管中加入160 μl(4滴)樣本稀釋液，向2～10號試管中分別加入80 μl(2滴)滴定液(甘氨酸-鹽酸緩沖液，含有防腐劑)，將40 μl樣本加入1號試管并混勻，從1號試管中吸取80 μl樣本混合轉移到2號試管并混勻，依次進行稀釋至10號試管。如果標本在1∶2560時仍呈陽性則需要繼續(xù)稀釋。將隱球菌抗原檢測試紙條的白端(即檢測端)分別浸入10個試管中，判讀方法同定性檢測，報告滴度為產生陽性結果的最高稀釋度。

4.治療及療效判定標準：按照2010年美國感染性疾病協(xié)會(American Association of Infectious Diseases，IDSA)隱球菌病治療指南[8]進行肺隱球菌病的治療。參照中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準工作組2012年制定的《侵襲性真菌感染質量控制》[9]標準中臨床癥狀及胸部CT表現(xiàn)等判定臨床療效，分為完全緩解、部分緩解、穩(wěn)定、進展/死亡。為進一步評價LFA檢測血清CrAg水平變化情況對療效的預測效果，本研究參照文獻[9]中“以治療3～12個月后患者完全緩解情況評價肺隱球菌病的療效趨勢”，分析治療后3、6、9個月時LFA檢測血清CrAg滴度改變情況，以評價是否對治療6、9、12個月時的臨床完全緩解具有預測能力。

5.統(tǒng)計學處理：采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析，非正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1，Q3)]表示，計數(shù)資料以例(構成比或緩解率，%)]表示。以檢測時間窗為橫坐標，以半定量滴度值的自然對數(shù)轉換值(ln抗原滴度)作為縱坐標，繪制治療前高滴度組(滴度值≥160)與低滴度組(滴度值<160)抗原滴度值隨時間變化的趨勢線圖。由于本研究資料屬于重復測量設計，每期隨訪的患者例數(shù)會因抗原陰轉而呈現(xiàn)逐漸減少的情況，無法使用重復測量方差分析的方法分析不同時期抗原滴度變化。

以治療3、6、9個月后的血清CrAg滴度與開始治療時的滴度比值為預測變量(自變量)，以6、9、12個月時患者完全緩解時的滴度值為結局變量(因變量)，繪制ROC曲線以評價血清CrAg變化情況對療效的預測效果；使用約登指數(shù)尋找最佳改變截斷點，并計算該點對應的敏感度與特異度。

結 果

1.臨床治療與療效判定情況：27例患者使用不同藥品治療，其中21例采用氟康唑、3例采用伏立康唑、2例采用氟康唑+伏立康唑、1例采用伊曲康唑；24例采用單純抗真菌藥物治療、3例采用手術+抗真菌藥物聯(lián)合治療。治療前有臨床癥狀的23例患者，抗真菌治療3個月后癥狀基本消失；而2例肺泡灌洗液培養(yǎng)陽性患者抗真菌藥物治療1個月后陰轉。12例患者隨訪過程中胸部CT掃描顯示病灶基本吸收，僅見少許索條狀影，為完全緩解，分別為治療1個月時1例(術后改變)、3個月時2例、6個月時8例、9個月時11例、12個月時12例；而其他14例在治療12、15、18個月后胸部CT檢查顯示病灶呈漸進式吸收，仍可見斑點、斑片狀影及實變影等病灶，為部分緩解；僅1例患者在治療18個月時病灶未見明顯變化，持續(xù)呈穩(wěn)定狀態(tài)，為療效穩(wěn)定。不同治療時間點的抗原滴度水平及臨床療效判定情況見表1。

2.抗真菌治療前后血清CrAg水平檢測情況：27例患者治療前CrAg檢測均為陽性，半定量滴度值為5～5120，以治療前CrAg滴度的中位數(shù)160為截斷點，將27例患者分為14例高滴度組(滴度值≥160)與13例低滴度組(滴度值<160)?？拐婢委?、3、6、9、12、15、18個月后抗原檢測定性陰轉分別為1、5、9、11、14、15、18例，即總陰轉例數(shù)為18例，半定量中位數(shù)測定結果見表1、圖1，顯示隨著治療時間延長，抗原半定量滴度總體呈逐漸下降趨勢，僅1例患者因糖尿病并發(fā)腎病綜合征在治療1～6個月時呈現(xiàn)抗原滴度值水平無變化(持續(xù)為20)，而在9個月后突升為80，繼而呈逐漸下降趨勢，但臨床癥狀及胸部CT掃描未見惡化。

3.治療前的CrAg半定量滴度與臨床完全緩解的相關分析：進行治療前高滴度、低滴度組與臨床療效完全緩解的統(tǒng)計學分析，結果顯示低滴度組中位緩解時間為6.0(2.1～9.9)個月，高滴度組因為大部分患者在隨訪時間點內未達到完全緩解，記為刪失。至18個月隨訪期末，27例患者中隨訪12個月時累計有12例出現(xiàn)完全緩解(44.4%)，其中3例患者的滴度值為5、1例為10、2例為20、1例為40、2例為80、3例為160；故低滴度組12個月內的完全緩解累積緩解率(74.2%)高于高滴度組(21.4%)，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(表2，圖2)。

4.治療后LFA檢測血清CrAg變化情況與臨床療效相關分析：以治療3、6、9個月后的血清CrAg滴度(分別以CrAg3、CrAg6、CrAg9表示)與開始治療時的滴度(CrAg0)比值的百分比為預測變量(自變量)，以6、9、12個月時患者臨床療效為完全緩解時的滴度值為結局變量(因變量，分別以CR6、CR9、CR12表示)繪制ROC曲線，以評價LFA檢測血清CrAg水平變化情況對療效的預測效果(表3，圖3)。

5.治療后患者停藥及CrAg滴度檢測情況：所有患者治療12個月后，22例停止抗真菌藥物治療，但仍有13例抗原檢測陽性，滴度值為5～80；15個月后再有3例停止了抗真菌藥物治療，但仍有12例抗原檢測陽性，滴度值為40；18個月后最后2例患者也停用了抗真菌藥物，但仍有9例抗原檢測陽性，滴度值為5～20。

共計27條線表示27例患者，但一些個體線條發(fā)生重合。橫坐標為治療時間窗，縱坐標為半定量滴度值的自然對數(shù)轉換值(ln)；縱坐標刻度為0時表示抗原陰轉(總陰轉18例)

P=0.009為圖中實線下方經Log-rank檢驗的檢驗值；橫坐標為隨訪時間，縱坐標為各隨訪時期對應的累積緩解率

表1 27例患者不同治療時間點的抗原滴度水平及臨床療效

注a：抗原滴度值水平

表2 高、低滴度組患者12個月完全緩解情況比較

表3 CrAg滴度的相對改變對臨床完全緩解的預測水平

注a：治療后6、9、12個月時患者完全緩解情況以二分類結果[緩解例數(shù)(緩解率，%)]表示；AUC為ROC曲線下面積；Z值為實線下面積與50%假設檢驗的檢驗值

橫坐標為1—特異度(假陽性率)，縱坐標為敏感度(真陽性率)；CR為完全緩解；實線表示使用治療3、6、9個月后的血清CrAg滴度與開始治療時的滴度(CrAg0)比值預測CR時的ROC曲線，虛線表示隨機猜測CR的參考線

討 論

據(jù)一項國內多中心臨床調查報道，肺隱球菌病的發(fā)病率僅次于曲霉菌和念珠菌感染，位于真菌性肺病第三位[10]，成為肺部真菌感染的常見疾病。其臨床療效的評估主要依據(jù)臨床癥狀和體征、微生物學檢查、胸部影像學表現(xiàn)、治療時間等綜合判斷。但在血清CrAg檢測開始應用于臨床后不久，就有學者提出可以將CrAg定性檢測作為監(jiān)測隱球菌病病情、療效及預后的依據(jù)[11-12]，且隨著檢測技術水平的提高，使得乳膠凝集試驗、酶聯(lián)免疫分析法、LFA法成為目前常用的CrAg檢測方法，而LFA檢測因其操作簡便、費用較低等特點在臨床中得到更廣泛的應用。

本研究對LFA檢測血清CrAg陽性的27例非HIV感染肺隱球菌病患者進行監(jiān)測，結果顯示，隨著抗真菌治療時間(1、3、6、9、12、15、18個月)的延長，血清CrAg的陽性結果及半定量滴度動態(tài)測定均呈逐漸下降趨勢，從治療前的半定量滴定值為5～5120，降低到治療1個月后的滴定值為40、18個月后的滴定值為5；而且大部分患者在治療過程中CrAg檢測逐漸陰轉，而未陰轉的患者也處于5～20的低滴度值范圍，提示CrAg水平監(jiān)測有助于判定患者病情變化及抗真菌治療后的藥物療效，對療效觀察評價有重要價值。國內張萍海等[13]通過乳膠凝集試驗連續(xù)監(jiān)測肺隱球菌病患者治療前及治療過程中血清抗原滴度，其結果顯示CrAg滴度隨肺部病灶的吸收呈逐漸下降趨勢，與病程發(fā)展呈良好的正相關性；謝?；ǖ萚14]對22例LFA檢測陽性隱球菌性腦膜炎患者進行治療前后血清CrAg的滴度動態(tài)監(jiān)測，結果顯示治療前后血清CrAg的滴度水平變化差異有統(tǒng)計學意義；李娟等[15]通過對168例腦膜炎患者在病程不同階段的腦脊液進行CrAg乳膠凝集試驗，顯示腦脊液治療前后其抗原滴度變化也存在差異。以上研究均進一步說明了LFA動態(tài)檢測CrAg對療效評估的意義。分析原因可能與抗真菌藥物治療后，患者體內大量隱球菌被抗真菌藥物殺滅，死亡后的真菌細胞壁碎片被逐漸代謝出機體，釋放入血的CrAg也逐漸減少有關，從而使患者病情好轉，CrAg檢測陰轉或抗原滴度逐漸下降而處于低水平[16]。

根據(jù)IDSA隱球菌病治療指南，建議對非HIV感染的肺隱球菌病患者抗真菌治療療程為6～12個月。本研究顯示，隨著治療時間的延長，臨床完全緩解率呈增加趨勢、抗原滴定呈下降趨勢，但在治療12個月后臨床完全緩解率保持不變(一直保持44.4%)。通過LFA檢測治療3、6、9個月后CrAg滴度與治療前CrAg滴度百分比的比值對治療 6、9、12個月后的臨床完全緩解情況進行判定，結果顯示CrAg滴度與臨床完全緩解具有相關性(P值均<0.05)，特異度分別為75.0%、72.7%、83.3%、敏感度分別為89.5%、93.3、93.7%，說明治療后定期隨訪CrAg滴度檢測對其后繼的療效緩解及藥物治療療程判定有臨床意義，可以作為協(xié)助療效判定的一項輔助檢查手段。

臨床緩解的療效判定與病情輕重也呈密切相關，受到治療前抗原半定量滴度高低的影響。Beyene等[17]對治療3個月后的隱球菌病患者進行隨訪研究，結果顯示氟康唑在治療無癥狀隱球菌病患者比治療隱球菌性腦膜炎發(fā)病患者及LFA可檢測到血清CrAg滴度的患者治療效果更好；并發(fā)現(xiàn)當LFA檢測的血清CrAg滴度值≥1280時死亡率高達94%，而≤640時死亡率為38%，提示抗原滴度對隱球菌病患者的預后有明確影響，考慮機體抗原水平與病情輕重密切相關，抗原高滴度可認為機體隱球菌高負荷量、高定量，抗真菌治療困難，預后不佳。

據(jù)Wake等[18]對19 233例HIV感染者應用LFA檢測CrAg的調查報道，發(fā)現(xiàn)其血清CrAg半定量滴度值≥160是判定亞臨床隱球菌性腦膜炎的最佳截點(敏感度為88.2%、特異度為82.1%)。本研究以滴度值中位數(shù)160為截點將患者分為低滴度組和高滴度組，結果顯示低滴度組12個月的完全緩解率、累積緩解率均明顯高于高滴度組，提示滴度水平與累積緩解率呈明顯負相關。盡管本課題研究的是非HIV感染者，但以上結果顯示，LFA檢測血清CrAg半定量滴度值最佳截點在HIV感染者和非HIV感染隱球菌病患者中一致，可認為該最佳截點是評估病情輕重及臨床緩解的截點，考慮與細菌負荷量及病情輕重有關。

參照2012年《侵襲性真菌感染質量控制》[9]標準，有研究報道，目前非HIV感染隱球菌病患者經過規(guī)范抗真菌治療后大部分患者的治療結局為完全緩解或部分緩解，穩(wěn)定或進展較少，死亡患者極罕見[19-20]，說明該類患者臨床療效及預后良好。本研究患者治療12個月后12例完全緩解、14例部分緩解、1例穩(wěn)定，而隨訪過程中已按臨床療效停藥的患者，即使部分患者呈現(xiàn)臨床完全緩解，其抗原仍可顯示陽性，并且半定量滴度值維持在5～20。尚鵬程等[21]在隱球菌性腦膜炎患者中進行治療前后腦脊液和血清CrAg檢測比較，認為動態(tài)檢測CrAg水平可判定其療效，并發(fā)現(xiàn)即使真菌培養(yǎng)陰轉后，部分患者CrAg檢測仍為陽性，但半定量滴度值仍維持在較低水平，并持續(xù)較長時間不變，與本研究一致。分析原因可能是死亡的隱球菌在腦脊液或血清中清除緩慢，仍可持續(xù)釋放CrAg有關[22]，但滴度水平已很低，說明治療有效。由于臨床上停藥時機是通過臨床癥狀及胸部影像學表現(xiàn)來判定，故認為抗原滴度監(jiān)測可以用來判斷臨床療效，但不能作為停藥指標。

既往由于HIV感染者易患隱球菌病，導致國內外關于LFA檢測血清CrAg抗原在隱球菌病療效方面的研究、隱球菌病的診斷及治療共識均主要來源于HIV感染者的數(shù)據(jù)，使得本研究超過一半的參考文獻是針對HIV感染者，對于本研究中非HIV感染者間的差異性分析需要今后更多的研究予以討論。

綜上，LFA檢測血清CrAg是肺隱球菌病患者臨床診療過程中一項重要檢查，其陽性率及半定量滴度測定對病情緩解及療效評估有明確指導意義，但由于抗原在機體內清除較緩慢，有可能較長時間顯示檢測陽性或處于較低水平狀態(tài)，不能作為抗真菌停藥治療的指標。再者，由于項目涉及樣本量較少，以及隨訪時間不長，使得結果存在一定局限性，有待下一步擴大樣本量及隨訪時間進行更深入的研究。

志謝福建醫(yī)科大學林征老師對本研究統(tǒng)計學方面進行了指導與修正。