韋巖

菏澤市牡丹區(qū)菏澤醫(yī)學(xué)專科學(xué)校，山東菏澤 274000

AC133蛋白是1997年美國學(xué)者發(fā)現(xiàn)的一種新型造血細(xì)胞表面標(biāo)志，在第七屆過激白細(xì)胞分化抗原工作組會議上被正式的命名為CD133。目前，AC133蛋白中被發(fā)現(xiàn)有兩種同源性的抗原，即CD133-1與CD133-2分子，臨床研究發(fā)現(xiàn)，兩種抗原分子分別在人類2號、4號染色體上定位。有關(guān)研究證明，CD133在造血系統(tǒng)中的CD34細(xì)胞亞群的表達上，約占有37%～74%的表達比例。CD133-1與CD133-2在不一樣的組織內(nèi)的表達水平有著明顯的差異性，如在成人骨骼、胎腦等組織中，CD133-1的表達顯著優(yōu)于CD133-2，而在心臟、骨骼肌等較為成熟的組織中，CD133-2表達顯著優(yōu)于CD133-1。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，白血病細(xì)胞上也呈現(xiàn)CD133的抗原表達，但具體的CD133抗原表達同白血病細(xì)胞生物學(xué)特性之間的臨床關(guān)系仍未有明確的表明。因此，針對兒童B系急性淋巴細(xì)胞白血?。˙-ALL）關(guān)于CD133兩種亞型分子CD133-1、CD133-2的相關(guān)表達進行在研究，對比CD133-1、CD133-2存在的差異性。該研究中，通過對2017年1月—2018年9月50例B系急性淋巴細(xì)胞白血病患兒初診時和治療1個月后，CD133-1與CD133-2表達變化情況，分析兩種亞型分子同CD34表達之間存在的相關(guān)性,并對B-ALL致病因素，如年齡、性別、異常的細(xì)胞遺傳學(xué)、FAB亞型、骨髓幼稚細(xì)胞比例、基因融合表達、完全緩解率、染色體、微量殘留病 (MRD)等進行分析，以此來表明CD133-1、CD133-2二者在B-ALL患兒中的動態(tài)表達特征。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取該院收治的50例B系急性淋巴細(xì)胞白血病患兒作為研究A組，其中，男童24例，女童26例，年齡6～13歲；治療1個月后的25例(同初診時50例患兒相匹配)作為B組,其中男童14例，女童11例，年齡6～13歲。同時選取同一時期該院接診治療的外科患兒12例作為C組(正常即指骨髓象、外周血象均為正常)，其中，男童7例，女童5例，中年齡4～14歲。入選的患兒均經(jīng)過其家屬同意并簽署知情同意書，均實施過常規(guī)性治療，該研究已經(jīng)該院的醫(yī)學(xué)倫理會同意開展。A組在初診時采取的化療方案為CCLGALL-2008方案，診斷的分型標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)兒童急性淋巴細(xì)胞白血病診療建議進行確診。

1.2 研究方法

1.2.1 B-ALL患兒CD133-1、CD133-2表達的流式細(xì)胞術(shù)檢測 使用10 mL的注射器采集所有入選研究對象的骨髓液，使用肝素鈉對骨髓液進行抗凝；使用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液獲取獲得單個核細(xì)胞(MNC)。 分別取試管a、試管 b，并將50 μL的單個核細(xì)胞分別加到試管a和b中，同時，將CD34、CD45、CD19 和 CD133-1 加入試管 a中，CD34、CD45、CD19和 CD133-2 加入試管 b 中，(CD34、CD45、CD19等單克隆抗體均從美國Becton Dickinson公司購買，CD133-1、CD133-2兩種亞型分子先避光孵育30 min后，再將100 μL的磷酸鹽緩沖液加入其中，待完成重懸后，立即使用上流式細(xì)胞儀進行分析[1]。CD45采取設(shè)門方式，來達到MNC分群于前向角/側(cè)向角的光散射(FSC/SSC)，R1門圈所圈定的MNC將紅細(xì)胞的碎片排出出去，設(shè)細(xì)胞的獲取值為R1=10 000個細(xì)胞；后參照同型對照對M窗進行相關(guān)調(diào)整，對細(xì)胞的陽性、陰性進行界定，當(dāng)細(xì)胞的表達比例大于20%時，該表達為陽性表達，反之，為陰性表達，分析結(jié)果時，采用CellQuest Pro軟件做相關(guān)分析[2]。

1.2.2 B-ALL患兒MRD水平的監(jiān)測 采用CD22/CD10/CD34/CD19、TdT/CD10/CD34/CD19、CD66c/CD10/CD34/CD196、CD38/CD10/CD34/CD19、CD58/CD10/CD34/CD19、CD45/CD10/CD34/CD19等6組4色單克隆抗體組合的流式細(xì)胞術(shù)對本組的B-ALL患兒的MRD進行檢測[3]。采取CellQuest Pro軟件對結(jié)果進行分析。對比同一B-ALL患兒初診時、治療1個月后的MRD監(jiān)測結(jié)果,對MRD進行篩選時，選出雙參數(shù)點圖上白血病細(xì)胞所出現(xiàn)的位置，若在監(jiān)測時，仍發(fā)現(xiàn)該位置有細(xì)胞出現(xiàn)，則可判斷該細(xì)胞為白血病的殘留細(xì)胞，計算此些細(xì)胞在骨髓中MNC所占比例，對MNC進行計算時，每次應(yīng)獲得的MNC至少有1 000個,白血病的殘留細(xì)胞數(shù)量應(yīng)大于1×10-4，即在1 000個正常細(xì)胞中，將會出現(xiàn)1個白血病細(xì)胞視為MRD的陽性標(biāo)準(zhǔn)[4]。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對該研究的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析處理，計量資料采?。ā纒）表示，兩組間比較采取t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD133表達與B-ALL一般臨床指標(biāo)的關(guān)系

檢測結(jié)果表明，A組的B-ALL患兒在初診時，其骨髓樣本的CD133-1表達水平、CD133-2表達水平同外周血中的白細(xì)胞差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)；BALL中，CD133-1、CD133-2表達為陽性同白血病的危險等級差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；染色體：采取Logistic線性回歸分析分析 B-ALL中 CD133-1、CD133-2表達與染色體之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)染色體的異常同CD133-1、CD133-2的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(CD133-1 的 b=0.013，P=0.234；CD133-2 的 b=0.001,P=0.567)，這說明CD133-1、CD133-2在不一樣的染色體異?；純褐?，其表達無顯著相關(guān)性；融合基因：采取Logistic線性回歸分析分析B-ALL中CD133-1、CD133-2表達與融合基因之間無顯著相關(guān)性（CD133-1的 b=-0.01,P=0.425；CD133-2 的 b=-0.012,P=0.356），這表明，CD133-1、CD133-2 在不一樣的融合基因患兒中的表達無選擇差異性。

2.2 B-ALL的CD133亞型分子陽性表達比較

結(jié)果顯示，C個月正常的12例兒童的CD133-1、CD133-2表達均顯示為陰性，即此些兒童的細(xì)胞表達比例均小于20%,且其具體的陽性細(xì)胞表達的比例CD133-1為 10.24%(5.36%～18.69%)，CD133-2 比例為5.68%(2.28%～10.66%)。初診A組患兒50例中，CD133-1表達為陽性的有19例 (38.00%)，表達為CD133-2的有31例(62.00%),CD133-1表達、CD133-2表達相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；治療1個月后的B組患兒中，CD133-1表達為陽性有3例(12.00%),CD133-2表達為陽性有22例 (88.00%),CD133-1表達、CD133-2表達相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 初診B-ALL患兒CD133表達與CD34表達的相關(guān)性分析

對CD133和CD34之間的相關(guān)性進行分析，結(jié)果顯示，B-ALL患兒初診時，CD133-1表達水平、CD133-2表達水平同CD34表達水平村存在顯著的差異性,但CD133和CD34之間兩者的表達水平無相關(guān)性(CD133 的r=0.156，P=0.268，CD34 的r=0.087，P=0.358)，見表 1。

表1 初診B-ALL患兒CD133表達與CD34表達的相關(guān)性分析[（±s），%]

表1 初診B-ALL患兒CD133表達與CD34表達的相關(guān)性分析[（±s），%]

注：CD133 與 CD34 比較，P＜0.05。

分子水平CD133-1 CD133-2 CD34 29.68±37.54 43.56±34.25 63.22±38.35

2.4 B-ALL患兒MRD水平同表達與CD133-1表達水、CD133-2表達水平的關(guān)系

直線相關(guān)分析顯示，治療1個月后，B-ALL患兒的MRD水同同一時期的CD133-1表達水平進行比較，發(fā)現(xiàn)無明顯相關(guān)性(r=0.1.61，P=0.656)；而同一時期的CD133-2表達水平進行比較，發(fā)現(xiàn)有明顯相關(guān)性(r=0.411，P=0.051），見圖 1。

圖1 B-ALL患兒MRD水平同表達與CD133-1表達水、CD133-2表達水平的關(guān)系

3 討論

通過對健康人群骨髓MNC后的CD133細(xì)胞功能進行研究發(fā)現(xiàn)，CD133細(xì)胞可對重建造血細(xì)胞、起始細(xì)胞等起到長期培養(yǎng)的作用，可在原始造血細(xì)胞在移植到新宿主之后，起到細(xì)胞的長期植活作用[5]。有關(guān)研究表明，起始細(xì)胞主要在CD133*CD34的亞群中存活，這表明了CD133可作為原始造血細(xì)胞群的標(biāo)志物，且CD133相較于CD34，是更早的細(xì)胞表面標(biāo)志物。

該研究針對兒童B系急性淋巴細(xì)胞白血病 （BALL）關(guān)于CD133兩種亞型分子CD133-1、CD133-2的表達情況進行研究，發(fā)現(xiàn)在初診時，B系急性淋巴細(xì)胞白血病患兒50例中，CD133-1表達為陽性的有19例 (38.00%)，CD133-2表達為陽性的的有 31例(62.00%)，(P＜0.05)；這與趙文理等人[6]研究的 64 例 BALL患兒在初診時CD133-1表達為陽性的有24例(37.50%)，CD133-2表達為陽性的的有39例(60.93%)(P＜0.05)，與該研究結(jié)果相一致；在治療1個月后，25例患兒中，CD133-1表達為陽性有3例 (12.00%),CD133-2表達為陽性有22例(88.00%)(P＜0.05)，且BALL患兒的CD133的表達同患兒的年齡、性別、異常的細(xì)胞遺傳學(xué)、FAB亞型、骨髓幼稚細(xì)胞比例、基因融合表達、完全緩解率、白血病危險等級等因素?zé)o顯著的相關(guān)性。而朱瑩瑩等人[7]研究發(fā)現(xiàn)，在對32例BALL患兒后，其中18例患兒中，CD133-1表達為陽性的有 2例 (11.11%)，CD133-2表達為陽性有 12例(83.33%)(P＜0.05)， 且也研究發(fā)現(xiàn)，B-ALL 患兒的CD133表達同患兒的年齡、性別、異常的細(xì)胞遺傳學(xué)、基因融合表達及白血病危險等級等因素不存在明顯的相關(guān)性，與該研究結(jié)果一致。同時，該研究發(fā)現(xiàn)，CD133-2表達在造血干細(xì)胞中占有較為顯著的優(yōu)勢,且還推測CD133-2表達可被AC141、AC133等單克隆抗體同時識別出來，由此推測，CD133-2有可能在某一些血液系統(tǒng)中有著更高的表達水平。而該研究的B-ALL患兒經(jīng)治療后，其CD133-1表達已下降至正常的表達水平，而CD133-2表達在初診時的水平較高，在經(jīng)治療后，雖有所下降，但并未下降到正常的水平狀態(tài)，通過分組對比分析，發(fā)現(xiàn)B-ALL患兒在初診時，其CD133-1表達水平、CD133-2表達水平存在顯著的差異性，且CD133-2的表達水平較CD133-1的表達水平更高，兩組之間相比較具有顯著的相關(guān)性，而在其余的時間點相比較無相關(guān)性。B-ALL患兒在初診時，CD133的表達水平同CD34之間無顯著的相關(guān)性，但同CD34表達水平之間存在顯著的差異性，這同國內(nèi)外的有關(guān)研究結(jié)果相一致[8]。

目前，許多研究均表明在白血病患者的體內(nèi)，均有一些微量細(xì)胞群LSC存在，且此種細(xì)胞群一般情況下不會對化療藥物發(fā)生敏感作用,而這又是致使白血病復(fù)發(fā)的根源?？拱┧幬锬軞⒊梭w內(nèi)大量的白細(xì)胞，但卻難于將細(xì)胞內(nèi)的MRD殺除，進而致使白血病的復(fù)發(fā)。而有關(guān)研究表明，CD133-2陽性亞群中，可能有一些正常的造血細(xì)胞存在，五法將LSC的特性正確反映出來，因此，對于CD133這一可能存在的新型腫瘤標(biāo)志靶點，使用抗CD133的抗體結(jié)合相關(guān)藥物治療，將是將CD133腫瘤細(xì)胞清除的較為有效的治療舉措。

綜上所述，為有效治療兒童B系急性淋巴細(xì)胞白血病，在探討LSC的本質(zhì)，對相關(guān)細(xì)胞群進行鑒定時，要保持高嚴(yán)謹(jǐn)態(tài)度，分析CD133的表達指標(biāo)，充分鑒定CD133-2分子，為下一步利用CD133-2治療兒童B系急性淋巴細(xì)胞白血病奠定基礎(chǔ)。