盧韓楊 潘文靜 馬曉潔 李 勤 劉 洋

(河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 新鄉(xiāng) 453007)

隨著中國城鎮(zhèn)化進程的加速, 城市基礎(chǔ)建設(shè)不斷完善, 城市景觀水體不僅兼顧了蓄水防洪等生態(tài)功能, 更是市民休閑娛樂的場所。人為影響導(dǎo)致了其水質(zhì)變化較大, 富營養(yǎng)狀況不容樂觀。牧野湖是位于河南省新鄉(xiāng)市的一個人工湖, (N35°18′13.71″,E113°55′15.05″), 與貫穿新鄉(xiāng)市區(qū)的衛(wèi)河相連, 總面積約2.23×105m2, 平均水深約1.5 m; 人民公園水域相對獨立, 面積約1.9×104m2。兩水體水流較為緩慢, 水體的水質(zhì)較差, 已有研究對牧野湖的浮游植物分布[1]進行了報道, 長期的監(jiān)測發(fā)現(xiàn)兩水體在夏季均會出現(xiàn)藍藻水華, 主要以單細胞和絲狀藍藻為主[2]。

生物固氮是地球氮素循環(huán)中重要的環(huán)節(jié), 目前已知的固氮生物主要限于原核生物, 而固氮藍藻便是其中一個類群[3,4]。富營養(yǎng)水體中的固氮類群種類多樣, 且不同水體具有地域差異, 雖然固氮過程對于固氮微生物而言是一個主動耗能的過程[5], 但在富營養(yǎng)水體仍具有微弱的固氮效率[6], 在這其中固氮微生物與固氮藍藻的貢獻如何, 目前報道較少,本研究選取了兩個城市小型景觀水體, 借助高通量測序手段來研究其內(nèi)部固氮微生物類群組成及多樣性情況, 并對水體進行了原位固氮率的檢測, 來綜合評估固氮微生物的固氮作用及固氮藍藻可能的貢獻。

1 材料與方法

1.1 水樣采集和理化指標(biāo)測定

在新鄉(xiāng)市牧野湖和人民公園水體各設(shè)置3個采樣點(圖 1), 采樣時間為2016年8月, 用2 L采水器對水體采樣, 將水樣帶回實驗室進行微孔濾膜(Millipore, 0.2 μm)過濾, 過濾200 mL用于DNA提取。水體的理化指標(biāo)： 總氮(TN)、總磷(TP)、氨氮(-N)、化學(xué)需氧量(COD), 使用紫外可見多參數(shù)水質(zhì)測定儀(連華科技, 北京)進行測定, 水溫、pH和透明度均為現(xiàn)場測定。

1.2 16S rDNA和nifH基因高通量測序

濾膜總DNA的提取采用CTAB法[7], 提取的DNA保存于-20℃, 用于PCR及高通量測序?qū)嶒?。為確定兩個水體中原核生物群落的多樣性, 采用16S通用引物341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R (5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)[8], 固氮微生物多樣性檢測選用通用引物nifH1(5′-TGYGAYCCNAARGCNGA-3′), nifH2 (5′-ADNGCCATCATYTCNCC-3′)[9], 借助Illumina HiSeq測序平臺, 測序量不低于總量(50000)的98%,得到的具有某些干擾數(shù)據(jù)的原始數(shù)據(jù), 對原始數(shù)據(jù)進行一定的過濾, 就可以整理出有效數(shù)據(jù), 這樣結(jié)果更準(zhǔn)確無誤。將相似度＞97%的有效序列, 可以劃分為一類, 作為1個分類操作單元(Operational Taxonomic Units, OTU)。根據(jù)OTU對物種的種類進行說明, 得到物種種名信息, 對物種進行分類。從不同層次(門、綱、目、科、屬、種)對物種進行多樣性及所占比例進行計算[10,11]。運用Origin9.1軟件進行作圖, 不同水平層次的物種的相對豐度柱狀圖。采用Qiime17.0進行Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Coverage指數(shù)的計算, 根據(jù)指數(shù)值的大小可以反映出采樣點的水體群落內(nèi)生物多樣性。

1.3 水體固氮作用檢測

本實驗采用乙炔還原法對水體微生物固氮作用進行檢測[12]。將一定量的樣品放入300 mL培養(yǎng)瓶中, 使氣液比為1:5, 塞上膠塞, 抽出2 mL空氣后,立即注入相同體積的純乙炔氣體, 放入培養(yǎng)室, 模擬當(dāng)?shù)販囟群凸庹? 培養(yǎng)2h后, 用微量注射器抽取100 μL進樣檢測。通過氣相色譜儀確定標(biāo)準(zhǔn)曲線,并以實驗室培養(yǎng)的固氮藍藻魚腥藻PCC 7120作為對照。使用氣相色譜儀為Thermo TRACE 1300, 填充柱(GDX-502, 中科凱迪化工), 檢測器為FID檢測器, 對樣品進行檢測分析。

2 結(jié)果

2.1 水體理化指標(biāo)

水體中氮磷含量是表征水體富營養(yǎng)化的重要指標(biāo), 從表 1可以看出牧野湖和人民公園的總氮、總磷含量均處于水體富營養(yǎng)化狀態(tài)(總氮含量0.3 mg/L、總磷含量0.05 mg/L)[13], 牧野湖和人民公園水體溫度相差不大, 水體pH均呈堿性。人民公園水體化學(xué)需氧量明顯比牧野湖的高, 其水體透明度則相對較低, 表明人民公園水體受有機物質(zhì)的污染更嚴(yán)重,這可能與牧野湖水體具有流動性, 而人民公園水體相對封閉有關(guān)。牧野湖和人民公園所表現(xiàn)出嚴(yán)重的富營養(yǎng)化狀態(tài)以及堿性的水環(huán)境可能是水華暴發(fā)的主要因素[14]。

2.2 測序結(jié)果分析

圖 1 牧野湖和人民公園采樣點分布Fig. 1 Sampling sites of Muye Lake and People’s Park

表 1 各采樣點理化指標(biāo)結(jié)果Tab. 1 Physical and chemical index of each sampling site

16S rDNA高通量測序結(jié)果 通過高通量測序技術(shù)對水體細菌的16S rDNA的V3-V4可變區(qū)進行測序。為了提高后期測序信息分析的結(jié)果的準(zhǔn)確性, 對原始數(shù)據(jù)進行過濾處理之后, 最終得到148507條有效序列。牧野湖和人民公園測序得到的有效序列分別是73879條 (表 2)、74628條。對所有樣品具有97%的相似性的序列聚類成一個OTU,兩個水體的有效序列共劃分出1982個OTU, 其中牧野湖劃分出983個OTU, 人民公園劃分出999個OTU。牧野湖的OTU數(shù)略低于人民公園。

對兩個水體從門到屬依次進行分類(表 2), 牧野湖的細菌有32個門、60個綱、107個目、186個科、275個屬。人民公園的細菌有31個門、55個綱、101個目、171個科、238個屬。

nifH基因高通量測序結(jié)果 高通量測序得到180899條有效序列。牧野湖和人民公園測序得到的有效序列分別是92537條、88362條。兩個水體的有效序列共劃分出1408個OTU, 其中牧野湖劃分出1208個OTU, 人民公園劃分出200個OTU。牧野湖的OTU數(shù)量遠遠高于人民公園。對兩個水體從門到屬依次進行分類(表 3), 牧野湖的固氮微生物有9個門、15個綱、32個目、43個科、66個屬。人民公園的固氮微生物有4個門、9個綱、9個目、10個科、13個屬。

2.3 水體細菌群落結(jié)構(gòu)

牧野湖、人民公園水體中相對豐度最高的菌群是變形菌門分別占59%和43%, 牧野湖中相對豐度較高的依次有擬桿菌門和藍藻門, 分別占17%和13%; 人民公園水體中相對豐度較高的依次有擬桿菌門、放線菌門和藍藻門, 分別占15%、15%和10%, 在牧野湖水體中的放線菌門所占比例僅為4%。變形菌門在2個水體中都占據(jù)了絕對優(yōu)勢, 牧野湖藍藻所占比例較人民公園相對高一些。其中厚壁菌門和綠彎菌門也均存在于2個水體中(圖 2A)。

在綱水平上對豐度前10的細菌進行分類。圖 2B表明： 牧野湖和人民公園水體中最有優(yōu)勢的細菌是α-變形菌綱(Alphaproteobacteria), 分別占24.9%和15.4%, 其次是β-變形菌綱(Betaproteobacteria), 分別占20.3%和12.9%。其中α-變形菌綱和β-變形菌綱在牧野湖中所占比例相對較高。

2.4 水體固氮微生物群落結(jié)構(gòu)

如圖 3A所示, 牧野湖中固氮微生物種類相對較豐富, 有變形菌門、藍藻門和厚壁菌門等; 而人民公園固氮微生物種類較少, 主要有藍藻門、變形菌門和未分類的一些微生物。其中牧野湖水樣中固氮藍藻占3%, 人民公園水樣中固氮藍藻占9.3%,2個水體中固氮藍藻所占總體比例不高。

圖 3B結(jié)果表明： 在目水平上, 牧野湖和人民公園的顫藻目分別占0.1%和0.06%, 念珠藻目分別占0.09%和0.001%。牧野湖中的色球藻目占0.01%, 真枝藻目占0.009%。牧野湖中固氮藍藻物種多樣性高于人民公園。

2.5 水體細菌群落和固氮微生物群落組成差異

細菌群落組成差異 通過多樣性指數(shù)可以反映出樣本的豐富度和均勻程度。從表 4可以看出： 2個水體的覆蓋率指數(shù)均在99%以上, 說明此次測序比較接近樣本真實情況。通過Chao1、ACE、Shannon、Simpson指數(shù)可知, 人民公園的細菌群落相對較豐富, 細菌群落多樣性相對較高, 和OTU結(jié)果一致。結(jié)果表明水體細菌多樣性和豐富度應(yīng)該和水體水質(zhì)有一定關(guān)系。

表 2 細菌16S rDNA序列分析Tab. 2 Sequence analysis of bacterial 16S rDNA

表 3 各采樣點固氮微生物序列分析Tab. 3 Sequence analysis of nitrogen-fixing microorganisms in different sampling sites

圖 2 各采樣點門水平(A)優(yōu)勢細菌分布與綱水平(B)優(yōu)勢細菌分布Fig. 2 The dominant bacteria in each samling site at phylum level (A) and class level (B)

圖 3 門水平(A)與目水平(B)固氮微生物豐度Fig. 3 Richness of nitrogen-fixing microbial at phylum level and order level

表 4 細菌群落Alpha多樣性指數(shù)Tab. 4 Alpha diversity indexes of bacterial community

圖 4A結(jié)果表明： 人民公園的Rank Abundance曲線相對比牧野湖的曲線寬, 說明人民公園的物種組成較豐富, 此結(jié)果與Chao1、ACE指數(shù)相一致。牧野湖和人民公園的Rank Abundance曲線相對較平緩, 兩者物種組成比較均勻, 物種分布均勻程度相差不大。

根據(jù)所有樣品之間共有、特有的OTU進行韋恩圖(Venn Graph)的繪制, 圖 4B可知： 牧野湖和人民公園共有698個OTU, 牧野湖特有的232個OTU,人民公園特有301個OTU。這說明2個水體中物種組成相似度比較高。

圖 4 Rank Abundance曲線(A)與基于OTU的venn圖(B)Fig. 4 Rank Abundance Curve (A) and OTU-based venn Graph(B)

固氮微生物群落組成差異 從表 5可以看出： 2個水體的覆蓋率指數(shù)均在99.5%以上, 說明此次測序比較接近樣本真實情況。通過Chao1、ACE、Shannon、Simpson指數(shù)可知, 牧野湖的固氮微生物群落豐度和多樣性均較高, 和OTU結(jié)果一致。

圖 5A Rank Abundance曲線表明： 牧野湖的曲線相對比人民公園的曲線寬, 說明牧野湖的物種組成比較豐富, 此結(jié)果與ACE、Chao1指數(shù)相一致。牧野湖Rank Abundance曲線平緩, 說明固氮微生物群落組成比較均勻, 固氮微生物群落種類相對較豐富。人民公園Rank Abundance曲線陡然下降, 說明物種多樣性低, 但其中優(yōu)勢固氮微生物所占比例并不高。

圖 5B可知： 牧野湖和人民公園共有OTU 103個, 牧野湖特有1099個OTU, 人民公園特有97個OTU。牧野湖和人民公園共有OTU比較少, 說明2個水體物種組成差異性較大。牧野湖的特有OTU比較多, 說明牧野湖水體物種組成多樣性更高。

2.6 水體固氮酶活檢測

對野外采集的水樣進行了原位培養(yǎng), 并對其進行氣體采集, 運用乙炔還原法進行測定。對照組為固氮魚腥藻PCC7120, 培養(yǎng)條件相同。牧野湖和人民公園兩個自然水體, 實驗結(jié)果顯示： 對照組魚腥藻PCC7120能夠?qū)⒉糠忠胰厕D(zhuǎn)化為乙烯(圖 6A), 具有可檢測的固氮酶活性, 2個樣品組在相同的條件下均未出現(xiàn)乙烯峰, 未表現(xiàn)出固氮活性(圖 6B、6 C)。推測在選取的樣點中固氮活性較為微弱, 或固氮微生物并未表現(xiàn)出固氮能力。

3 討論

目前, 水體富營養(yǎng)化形式依然較為嚴(yán)峻, 藍藻水華在眾多水體中存在, 長期的富營養(yǎng)化不僅對景觀造成影響, 也對水體中的微生物等類群的演替產(chǎn)生影響[15,16]。固氮類微生物參與了地球上重要的氮素循環(huán), 當(dāng)環(huán)境中的氮源能夠供給微生物生長,固氮作用可能會降低, 相反, 當(dāng)環(huán)境中缺乏氮源, 或者環(huán)境中的氮源無法滿足微生物生長的時候, 固氮類生物便會通過自身固氮系統(tǒng)進行[17—19]。然而目前發(fā)現(xiàn)的固氮微生物主要是原核類的, 其中藍藻就是其中的一類, 藍藻中的固氮藍藻能夠利用大氣中的氮合成自身生長所需的氮素, 這一過程是一個主動耗能的過程, 固定一分子的氮需要8個電子和消耗16個分子ATP[3,20], 因此, 對于大部分具有固氮能力的藍藻, 在氮(銨態(tài)氮和硝態(tài)氮)滿足的條件下, 基本不發(fā)生固氮行為[21]。有研究發(fā)現(xiàn), 固氮藍藻能夠降低濕地的除氮能力, 其所固定的氮能夠滿足部分非固氮藍藻的生長[22], 說明固氮藍藻的固氮能力較強。在大型水體中, 也發(fā)現(xiàn)固氮效率的時空特點及其環(huán)境影響因素。富營養(yǎng)化水體中的氮含量一般較高, 太湖氮年均含量為1.79—3.63 mg/L[23], 在高氮的情況下, 固氮微生物, 尤其是固氮藍藻的固氮效率及其固氮貢獻如何, 還不是很清楚。本研究所選取的兩個水體, 均處于富營養(yǎng)化狀態(tài), 我們發(fā)現(xiàn),固氮微生物類群(屬)仍然占據(jù)一定比例(5%和24%),不同水體具有一定的差異, 同時, 我們還發(fā)現(xiàn)在這些固氮的類群中, 固氮藍藻的比例為(3%和9.3%),推測固氮藍藻在富營養(yǎng)水體中對水體的氮的貢獻較小。雖然由于理化條件的不同, 兩個水體的總的原核生物構(gòu)成不相同, 固氮微生物的種類和數(shù)量也不同, 但固氮微生物在原核生物中的比例有共同趨勢, 相對含量較低。對水體的原位固氮率檢測發(fā)現(xiàn),在本研究的2個小型水體中, 未檢測出固氮酶活性,可能是水體的固氮活性較低, 儀器未檢測出。張波等[6]研究發(fā)現(xiàn)固氮活性受溫度影響較大, 但本研究中水樣的檢測主要在夏季, 因此, 水溫可能不是影響固氮活性的因素, 這可能與景觀水體受人為影響較大有關(guān), 但通過本研究, 我們得出在富營養(yǎng)水體中, 固氮藍藻對水體的氮貢獻率較低。

表 5 固氮微生物群落Alpha多樣性指數(shù)Tab. 5 Alpha diversity indexes of nitrogen-fixing microbial community

圖 5 Rank Abundance曲線(A)與基于OTU的venn圖(B)Fig. 5 Rank Abundance Curve (A) and OTU-based venn Graph(B)

圖 6 乙炔還原法測定固氮酶活性Fig. 6 Determination of nitrogenase activity by acetylene reduction