文/謝雨禮

（謝雨禮，畢業(yè)于南開大學(xué)化學(xué)系，獲

得中國科學(xué)院上海藥物研究所博士學(xué)位，在哥倫比亞大學(xué)從事博士后研究工作。2017年4月，創(chuàng)辦蘇州偶領(lǐng)生物醫(yī)藥有限公司，致力于創(chuàng)新化藥的研究和開發(fā)）

回顧2019年的行業(yè)熱點(diǎn)，小分子藥物的熱度在免疫療法的喧囂過后似乎有所回升，其中最大的亮點(diǎn)就是安進(jìn)公司的KRAS G12C小分子抑制劑AMG510。繼ASCO后，9月中旬，安進(jìn)在巴塞羅那的世界肺癌大會(huì)（WCLC）上更新了AMG510的一期臨床數(shù)據(jù)：攜帶KRAS G12C突變的非小細(xì)胞肺癌病人中，960mg高劑量組ORR達(dá)到54%，疾病控制率100%，未見明顯毒副反應(yīng)?？紤]到這些病人都是經(jīng)過重度治療的，這個(gè)數(shù)據(jù)算是比較亮麗的。其實(shí)，業(yè)界之所以感到興奮，可能并不是因?yàn)檫@個(gè)數(shù)據(jù)有多好，而是RAS這個(gè)被認(rèn)為不可成藥的“致癌基因之王”，經(jīng)過30年努力，其直接抑制劑第一次接近成功。

RAS是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤基因（oncogene）

為什么RAS在腫瘤中這么重要？這可能還得從腫瘤生物學(xué)的起源說起。19世紀(jì)末，巴斯德等巨匠的研究讓現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在抗感染領(lǐng)域獲得巨大成功。1876年，一個(gè)俄國人成功地將腫瘤組織從一只狗移植到另外一只狗。1908年，兩個(gè)丹麥科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，母雞白血病細(xì)胞中的提取物可以讓其他鳥類感染白血病。這些觀察和研究讓人們相信腫瘤也是病毒所致的傳染病。1910年，洛克菲勒研究所的Peyton Rous從一只來自紐約長(zhǎng)島的母雞中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)腫瘤病毒Rous Sarcoma Virus（RSV，勞氏肉瘤病毒）。此后，一系列導(dǎo)致動(dòng)物腫瘤的RNA和DNA病毒相繼被發(fā)現(xiàn)。致病機(jī)理也得到了合理的解釋：這些病毒（RNA病毒通過逆轉(zhuǎn)錄酶）可以將腫瘤基因整合到被感染的宿主細(xì)胞中，誘導(dǎo)惡變并維持腫瘤細(xì)胞的無限分裂。發(fā)現(xiàn)RSV的Peyton Rous和發(fā)現(xiàn)RNA病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的Howard Temin分別獲得1966年和1975年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。至此，人們深信腫瘤是一種病毒導(dǎo)致的疾病。

直到1974年，UCSF的J. Michael Bishop和他的博士后Harold Varmus通過DNA探針意外發(fā)現(xiàn)未被感染的正常細(xì)胞中也存在此前RSV病毒中發(fā)現(xiàn)的腫瘤基因SRC。原來，腫瘤基因早就存在于宿主的基因組當(dāng)中，遠(yuǎn)古時(shí)期，病毒從宿主細(xì)胞中獲得這些基因片段并加以改造，也就是說，病毒所攜帶的腫瘤基因其實(shí)來自我們自身。這些發(fā)現(xiàn)打開了以基因變異為基礎(chǔ)的現(xiàn)代腫瘤生物學(xué)的大門。Bishop和Varmus也因此在1989年獲得了該領(lǐng)域的第三個(gè)諾貝爾獎(jiǎng)。

Harvey和Kirsten等人在20世紀(jì)60年代分別發(fā)現(xiàn)了類似于RSV的逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的老鼠腫瘤基因Hras和Kras。1982年，Weinberg等實(shí)驗(yàn)室在人類膀胱癌細(xì)胞T24/EJ中也發(fā)現(xiàn)了HRAS，使得RAS成為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤基因。50多年過去后，RAS基因被發(fā)現(xiàn)是腫瘤中最常見的突變基因之一，30%的腫瘤攜帶RAS變異，如果算上RAS調(diào)控因子和信號(hào)通路上下游的變異，幾乎覆蓋所有腫瘤，RAS變異每年造成100萬以上的病人死亡，無愧是“腫瘤基因之王”。這也令人非常好奇，RAS到底具有什么神奇功能，令腫瘤細(xì)胞如此依賴。

RAS與腫瘤抑制基因pRb和p53一起成為腫瘤領(lǐng)域難以攻克的高地

談到RAS的致癌功能，又要提起腫瘤發(fā)生機(jī)制的主要假說SMT（Somatic Mutation Theory）。該理論認(rèn)為腫瘤來源于正常細(xì)胞，基因突變的驅(qū)動(dòng)下，獲得生存優(yōu)勢(shì)，不斷進(jìn)行適者生存的進(jìn)化，最后演變成具有基因組不穩(wěn)定、無限增殖和抗凋亡等十大標(biāo)志的腫瘤細(xì)胞。這十大標(biāo)志或者說能力都服務(wù)于腫瘤細(xì)胞的唯一目標(biāo)：無限復(fù)制而獲得永生。細(xì)胞的復(fù)制開始于休止期（G0），接收生長(zhǎng)因子信號(hào)的刺激后，啟動(dòng)分為四個(gè)階段（G1、S、G2和M）的細(xì)胞分裂周期。在這個(gè)周期中，母細(xì)胞一分為二，復(fù)制基因并均等地分配給兩個(gè)子細(xì)胞。腫瘤基因突變或者異?？梢则?qū)動(dòng)生長(zhǎng)因子信號(hào)失控，造成細(xì)胞不受控制的生長(zhǎng)和分裂。RAS處于各種信號(hào)通路的中樞位置，下游控制的通路包括Raf、PI3K和RalGDS等。RAS在分子水平上可以調(diào)控蛋白質(zhì)的合成，基因轉(zhuǎn)錄等過程；細(xì)胞水平上影響細(xì)胞形狀、生長(zhǎng)、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移等等。生長(zhǎng)因子受體EGFR、FGFR，以及轉(zhuǎn)錄因子Myc的變異也能驅(qū)動(dòng)腫瘤的形成，RAS既可以在這些腫瘤基因的下游傳遞放大信號(hào)，也可以反饋增強(qiáng)它們的致癌功能。

如果腫瘤基因突變就輕易導(dǎo)致腫瘤，物種進(jìn)化就不會(huì)保留它們。事實(shí)上，腫瘤的發(fā)生還需要對(duì)抗腫瘤抑制基因的作用。正常細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂和增殖是由復(fù)雜信號(hào)網(wǎng)絡(luò)所嚴(yán)格控制的。比如細(xì)胞周期中，遺傳物質(zhì)復(fù)制出錯(cuò)就可能被中止分裂。細(xì)胞周期中有一個(gè)重要節(jié)點(diǎn)叫作限制點(diǎn)（R point），處于G1期的中后段，細(xì)胞分裂一旦越過R點(diǎn)，就無法停止，即使沒有生長(zhǎng)因子的存在，細(xì)胞分裂也會(huì)進(jìn)行到底?？刂七@個(gè)R點(diǎn)的關(guān)鍵基因叫作pRb。在CDK/Cyclin的調(diào)控下，磷酸化的pRb通過控制轉(zhuǎn)錄因子E2F決定細(xì)胞周期是否可以越過R點(diǎn)。pRb是限制細(xì)胞不正常分裂的最重要的檢查點(diǎn)，自然也是至關(guān)重要的腫瘤抑制基因。與RAS一樣，幾乎所有腫瘤中，pRb的正常功能被抑制或者被破壞。另一個(gè)與pRb同等重要的腫瘤抑制基因是監(jiān)控細(xì)胞健康狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄因子p53。正常細(xì)胞一旦受到破壞，p53會(huì)中止細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂，啟動(dòng)修復(fù)機(jī)器，如果無法修復(fù)則啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。生長(zhǎng)因子失控或者是pRb功能缺失，也會(huì)導(dǎo)致p53介導(dǎo)的凋亡。大量突變和功能異常的腫瘤細(xì)胞如果希望永生，必須擺脫p53的控制，因此p53的功能喪失突變出現(xiàn)在三分之一的腫瘤之中，加上其相關(guān)通路的異常也是幾乎覆蓋100%的腫瘤。

這樣，RAS過度激活以及pRb和p53功能喪失成為導(dǎo)致腫瘤的三座大山，它們是目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤中突變最多的三個(gè)基因。這也說明它們處于腫瘤細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的最關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)上。廣義上說，絕大多數(shù)靶向藥物的靶點(diǎn)都處于這三個(gè)基因調(diào)節(jié)的信號(hào)通路中。俗話說擒賊先擒王，十分遺憾目前還沒有直接靶向這三個(gè)靶點(diǎn)的藥物出現(xiàn)。從生物學(xué)的角度上看，pRb和p53是腫瘤抑制基因，功能異常經(jīng)常體現(xiàn)在蛋白缺失或者功能被抑制，難以用藥物進(jìn)行干預(yù)。近年來，也有人嘗試用小分子糾正變異p53的構(gòu)象，恢復(fù)其野生型的功能。相關(guān)藥物APR-246和COTI-2已進(jìn)入臨床研究，但進(jìn)展緩慢，有效性仍未得到驗(yàn)證。乍一看，RAS相對(duì)于pRb和p53，作為異常激活的腫瘤基因，是更加理想的藥物靶點(diǎn)。事與愿違，經(jīng)過多年的探索，RAS被認(rèn)為是不可成藥靶點(diǎn)，攻克RAS成為制藥界的“哥德巴赫猜想”。

AMG-510與KRAS G12C復(fù)合物結(jié)構(gòu)

RAS蛋白的結(jié)構(gòu)、工作原理和調(diào)控機(jī)制

為什么RAS長(zhǎng)期以來被認(rèn)為不可成藥？這要從其結(jié)構(gòu)，工作原理和調(diào)控機(jī)制說起。RAS主要有三個(gè)亞型HRAS、KRAS和NRAS，其中，KRAS通過RNA剪接又表達(dá)兩個(gè)不同的蛋白KRAS4A和KRAS4B。RAS蛋白是一種21kDa大小，位于細(xì)胞膜上的，擁有GTPase酶活性的鳥嘌呤核苷結(jié)合蛋白。RAS是GDP/GTP循環(huán)控制的二進(jìn)制分子開關(guān)：GDP結(jié)合時(shí)處于“關(guān)”的狀態(tài)，而GTP結(jié)合則代表“開”的狀態(tài)。沒有刺激信號(hào)時(shí)，這種關(guān)開狀態(tài)的轉(zhuǎn)換非常緩慢。接收到信號(hào)后，鳥苷酸交換因子GEFs被招募到細(xì)胞膜上與RAS結(jié)合并釋放GDP。由于細(xì)胞中GTP的濃度遠(yuǎn)高于GDP，RAS蛋白迅速結(jié)合GTP，招募其下游信號(hào)通路的效應(yīng)蛋白進(jìn)入“開”的狀態(tài)。在GAPs（GTPase Activating Protein）的作用下，RAS的GTPase的活性被提高上千倍，其結(jié)合的GTP被水解成GDP，RAS重新進(jìn)入GDP結(jié)合的“關(guān)”的狀態(tài)，從而完成一個(gè)完整的循環(huán)。

RAS分子開關(guān)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)也得到了很好的闡釋。RAS蛋白1—166個(gè)氨基酸組成G-domain，這個(gè)結(jié)構(gòu)域在各亞型中高度保守，余下的23—24個(gè)氨基酸組成高度可變區(qū)（HVR）。D-domain帶有RAS的核苷酸結(jié)合口袋，包括P-loop（殘基10—17）、Switch I（殘基30-38）和Switch II（殘基60—67）等區(qū)域。從其名字可以判斷，Switch I和II是RAS功能切換的關(guān)鍵。GTP結(jié)合的活性狀態(tài)時(shí)，GTP分子中Gamma位磷酸分別與Switch I的T35和Switch II的G60形成氫鍵，像彈簧一樣將它們拉在一起。一旦GTP被水解，Gamma位磷酸被水解掉，Switch I和II被分開，回到GDP結(jié)合的非活性構(gòu)象。

從上述描述可以看出，GTP水解是淬滅RAS活性的關(guān)鍵步驟。不難想象，如果基因突變抑制了GTP水解，RAS蛋白將被鎖在激活狀態(tài)。正因?yàn)槿绱?，RAS最常見的突變就發(fā)生在G12、G13和Q61三個(gè)位置。前面提到RAS高效水解GTP需要GAP蛋白參與，GAP與RAS結(jié)合后，將一個(gè)精氨酸（arginine）殘基伸到催化位點(diǎn)，協(xié)助水解，這個(gè)殘基被稱作精氨酸手指（arginine finger）。結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究表明，除了脯氨酸，G12或G13替換成任何氨基酸，立體位阻將阻礙精氨酸手指進(jìn)入催化位點(diǎn)。Q61則是直接參與水解過程，協(xié)助定位一個(gè)水分子，穩(wěn)定水解反應(yīng)的過渡態(tài)。其他突變還有與GDP結(jié)合相關(guān)的氨基酸如A146。比較有意思的是，雖然各個(gè)亞型的D-domain和功能高度類似，但腫瘤中發(fā)現(xiàn)的RAS突變主要集中在KRAS（85%），NRAS（12%）次之，HRAS（3%）最少。最近的研究也許提供了部分解釋，他們發(fā)現(xiàn)KRAS4B而不是其他亞型通過HVR區(qū)域與calmodulin結(jié)合，從而抑制非經(jīng)典Wnt通路，有利于保持腫瘤細(xì)胞的干性狀態(tài)。