黨媛

摘要：禽多殺性巴氏桿菌是引起各種禽類巴氏桿菌病的病原菌。禽巴氏桿菌?。辞莼魜y、禽出血性敗血癥）是一種急性、敗血性、接觸性傳染病，該病的流行具有發(fā)病快、病程短、發(fā)病率和死亡率高等特點(diǎn)。禽多殺性巴氏桿菌為條件性致病菌，當(dāng)飼養(yǎng)管理突變、氣候突變、長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)韧饨缯T因出現(xiàn)時(shí)容易暴發(fā)，當(dāng)前禽巴氏桿菌病常呈地方流行或散發(fā)流行，尤以成年雞最為常見。筆者對(duì)采集的一例疑似禽巴氏桿菌病的病料，通過(guò)病原菌分離培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)室鑒定及藥敏試驗(yàn)等研究，對(duì)疫情的診治提供了科學(xué)的依據(jù)，并針對(duì)當(dāng)前多殺性巴氏桿菌臨床上的藥物濫用、耐藥性嚴(yán)重等問(wèn)題進(jìn)行簡(jiǎn)要分析，旨在為各養(yǎng)殖單位健康發(fā)展提供參考。

關(guān)鍵詞：禽;多殺性巴氏桿菌病;分離;鑒定

中圖分類號(hào)：S831文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：2095-9737（2019）10-0030-02

1?樣品來(lái)源與試劑

病料采自青海省西寧市某規(guī)模化養(yǎng)雞場(chǎng)疑似禽多殺性巴氏桿菌感染的病死雞肝臟組織。培養(yǎng)基及試劑主要有胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）培養(yǎng)基、新生牛血清、2×Taq PCR Master Mix、DNA Marker、革蘭氏染色液、細(xì)菌藥敏紙片等。

2?實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

2.1?細(xì)菌分離培養(yǎng)

將采集的肝臟組織劃線接種于含2%新生牛血清的TSA平板、麥康凱平板上，37℃培養(yǎng)18 h后，觀察菌落形態(tài)，在TSA平板上出現(xiàn)淡灰白色、圓形、表面光滑、邊緣整齊、濕潤(rùn)、半透明菌落，麥康凱平板上無(wú)菌落。挑取TSA平板上可疑單菌落傳代培養(yǎng)，并對(duì)典型的疑似菌落進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡下觀察細(xì)菌染色特點(diǎn)及形態(tài)，鏡下可見兩端鈍圓、兩極濃染、革蘭陰性小桿菌。

2.2?生化試驗(yàn)

根據(jù)說(shuō)明書，取分離菌株純培養(yǎng)物分別接種葡萄糖、麥芽糖、果糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、肌醇、VP、硫化氫、賴氨酸和鳥氨酸、尿素酶等生化管。生化試驗(yàn)結(jié)果顯示該分離株可發(fā)酵葡萄糖、果糖、蔗糖、山梨醇，不發(fā)酵麥芽糖、乳糖、甘露醇、肌醇，VP、硫化氫、賴氨酸和鳥氨酸反應(yīng)均為陰性，這與多殺性巴氏桿菌生化特征相符。

2.3?PCR鑒定

根據(jù)禽多殺性巴氏桿菌特異性基因kmt1設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。引物序列如下，P1：5'-AT CCGCTATTTACCCAGTGG-3'，P2：5'-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3'，擴(kuò)增片段為456bp;挑取單個(gè)疑似菌落于100 μL無(wú)菌的ddH2O中，沸水中煮沸10 min，8000 r/min離心5 min，取上清液作為PCR模板;PCR體系為：2×Taq PCR Master Mix 10 μL、上下游引物各0.5 μL、模板1 μL，補(bǔ)滅菌水至20 μL，同時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照選用標(biāo)準(zhǔn)株C48-2株（CVCC44802），反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后用1%的瓊脂糖凝膠板電泳，電泳結(jié)束后，取出凝膠板用凝膠成像儀進(jìn)行成像分析，目的條帶的大小與預(yù)期相符，由此可以確定該場(chǎng)養(yǎng)雞場(chǎng)感染了禽多殺性巴氏桿菌。

2.4?藥敏試驗(yàn)

采用Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法對(duì)該分離多殺性巴氏桿菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選擇包括青霉素、氨芐西林、阿奇霉素、阿莫西林克拉維酸、頭孢噻呋、頭孢克洛、氟苯尼考、恩諾沙星、大觀霉素、紅霉素、慶大霉素、克林霉素、阿米卡星、多西環(huán)素和多黏菌素B共計(jì)15種臨床常用的藥敏片。首先將純化后的分離菌均勻涂布到含2%新生牛血清的TSA平板上，再將15種藥敏片均勻分布到平板上，37℃培養(yǎng)18 h后，觀察并測(cè)量各藥敏紙片的抑菌圈直徑，進(jìn)而對(duì)該多殺性巴氏桿菌分離株的藥物敏感性進(jìn)行判定。結(jié)果顯示該分離菌對(duì)頭孢噻呋、頭孢克洛、氟苯尼考呈現(xiàn)高度敏感，對(duì)大觀霉素和多黏菌素B中敏，對(duì)阿奇霉素、多西環(huán)素低敏，其余耐藥。

3?討論

禽多殺性巴氏桿菌是禽霍亂的重要致病原，屬于條件致病菌，該菌可長(zhǎng)期存在于禽鼻腔、呼吸道等處，當(dāng)禽類機(jī)體抵抗力降低時(shí)感染發(fā)病，雞群一旦出現(xiàn)帶菌雞或染病雞，可通過(guò)被污染的飼料、飲水及環(huán)境等快速傳播，導(dǎo)致較高的發(fā)病率和死亡率，造成極其嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本研究從疑似感染禽多殺性巴氏桿菌的規(guī)?；B(yǎng)雞場(chǎng)，隨機(jī)采集疑似病料，通過(guò)分離培養(yǎng)、染色鏡檢、生化試驗(yàn)、PCR鑒定等，最終確定了該雞場(chǎng)感染了禽多殺性巴氏桿菌。并通過(guò)藥敏試驗(yàn)對(duì)該分離株藥物敏感情況進(jìn)行了鑒定，已將試驗(yàn)結(jié)果反饋給相關(guān)養(yǎng)殖單位，通過(guò)及時(shí)的、科學(xué)的診治，疫情得到了很好的控制，現(xiàn)已完全恢復(fù)正常生產(chǎn)。

養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)堅(jiān)持防優(yōu)于治的原則，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理工作，不斷提高動(dòng)物機(jī)體的免疫力，積極正確進(jìn)行疫苗免疫，發(fā)揮疫苗的預(yù)防作用。多殺性巴氏桿菌根據(jù)莢膜抗原的不同可分為A、B、D、E、F五個(gè)血清型，且不同血清型之間缺乏交叉保護(hù)作用，目前多殺性巴氏桿菌病的預(yù)防多以滅活苗免疫為主，但因不同區(qū)域流行菌株之間血清型的差異，使得疫苗免疫效果不理想，常出現(xiàn)免疫動(dòng)物仍感染發(fā)病。本次實(shí)驗(yàn)涉及的養(yǎng)殖單位雖然管理規(guī)范，也實(shí)施開展了定期疫苗免疫，分析發(fā)病的原因可能是由于該株多殺性巴氏桿菌與免疫的滅活苗疫苗株有所差異，導(dǎo)致免疫失敗，確診后該養(yǎng)殖場(chǎng)用分離的多殺性巴氏桿菌株進(jìn)行了自家苗的研制，并進(jìn)行了免疫，取得了理想的預(yù)防效果。