余 剛 ，司小花，沈思軍 ，郭延華 ，張 賓，代 蓉 *

（1.新疆兵團第十師181團農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，新疆 北屯 836001；2.新疆西部牧業(yè)股份有限公司，新疆 石河子 832000;3.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000；4.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆 石河子 832000）

羊毛中黑色素的含量和種類決定了羊毛的顏色，但對羊毛顏色的評定還是由主觀的肉眼觀測為主，影響羊毛顏色的因素有很多，如品種、性別、氣候、營養(yǎng)條件等，但黑色素的含量和種類是決定羊毛顏色的核心因素。動植物的顏色形成機制不同。植物的顏色主要是類胡蘿卜素和花青素共同作用呈現(xiàn)出五彩繽紛的顏色，昆蟲[1]和鳥類羽毛的顏色是由色素和羽毛結(jié)構(gòu)共同作用的結(jié)果[2,3]。對于哺乳動物而言，皮膚和毛發(fā)的顏色主要是由細(xì)胞內(nèi)黑色素的含量和種類不同決定的，其中酪氨酸來源的色素（黑色素及其衍生物）是決定毛色的主要原因[4]。

黑色素是黑色素細(xì)胞產(chǎn)生的一種不溶于水和大多數(shù)有機溶劑的無定形蛋白質(zhì)衍生物[5]，廣泛存在于高等動物的皮膚、粘膜、視網(wǎng)膜、軟腦膜、膽囊及卵巢處。黑色素包括真黑素(eumelanin,EM)和褐黑素(pheomelanin,PM)，二者的相對數(shù)量與分布決定了哺乳動物毛皮顏色由淺至深的多種表型。褐黑素為溶于堿的圓形紅色顆粒，能使皮膚或毛發(fā)表現(xiàn)為黃色和紅色；真黑素比褐黑素難溶，可使皮膚或毛發(fā)表現(xiàn)為褐色和黑色。Forrest等[6]鑒定出美利奴[3]羊皮膚中的黑色素細(xì)胞主要分布在皮膚的表皮-真皮邊界、外毛根鞘和毛球部，而毛球部是毛干黑色素產(chǎn)生的唯一部位。為明確毛發(fā)、皮膚及其他組織器官中黑色素的種類和含量[4]，研究人員嘗試了多種方法。與光譜法、高效液相色譜法（HPLC）等技術(shù)相比，化學(xué)分光光度法需要的設(shè)備價格低廉，操作簡便，可廣泛用于生產(chǎn)實踐。

在羊毛顏色形成的研究中，對羊毛顏色的鑒定多以肉眼觀測為主，缺少一個客觀科學(xué)的評定方法。范文瑞等利用烏賊黑比色法檢測了毛色不同的羊駝毛纖維中黑色素種類和含量，本研究借鑒了檢測羊駝毛纖維黑色素的方法，分析黑色素的含量和種類與羊毛纖維顏色間的關(guān)系，建立穩(wěn)定的中國美利奴羊毛纖維黑色素定量和定性檢測的方法，降低肉眼觀察毛色的產(chǎn)生的主觀影響，建立毛色表型的科學(xué)評定方法，同時也為深入分析有色毛形成的內(nèi)在機制提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

選擇不同毛色（白色3只，灰色3只，棕黑色7只）的中國美利奴[5]羊（軍墾型）（圖1），所有羊只都來源于新疆農(nóng)墾科學(xué)院試驗羊場，飼喂和管理條件相同。取肩胛部羊毛[6]樣品50 g，用于測定羊毛纖維直徑和羊毛黑色素含量。

圖1 不同毛色羊毛樣品

1.1 羊毛纖維細(xì)度檢測分析[7]

采集待測個體肩胛部毛樣[8]，無水乙醇漂洗2～3次，晾干；取適量洗凈羊毛樣品安裝固定在羊毛切片器上，取靠近皮膚的毛切片；切下的毛樣置于載玻片上，滴1～2滴石蠟油；輕微攪拌，使毛樣散開；蓋上蓋玻片，置于CU-4羊毛纖維細(xì)度分析儀選擇非凍干參數(shù)模式測量羊毛纖維細(xì)度，檢測數(shù)量≥300根。

1.2 羊毛黑色素含量及種類檢測分析[9]

采集的羊毛清洗晾干后備用。參考[7,8]烏賊黑比色法利用分光光度計檢測毛樣中堿性可溶性黑色素（ASM）、真黑色素（EM）和褐黑素的含量（PM）。

堿性可溶性黑色素含量：30 mg毛樣剪成小段置于5 mL離心管中，加3 mL 1M NaOH，85℃反應(yīng)4 h；取3 mg烏賊黑催粉劑于3 mL雙蒸水中，37℃超聲處理5 min，降解成更小的可溶性顆粒；400 nm以烏賊黑溶液調(diào)零分光光度儀；以3 mL 1M NaOH作為參比液，將分光光度儀調(diào)至100；400 nm下檢測烏賊黑和所有樣品的OD值。

10 mg毛樣中堿性可溶性黑色素含量=（烏賊黑含量/ml×樣品OD值）/烏賊黑OD值

真黑素含量：30 mg毛樣剪成小段置于5 mL離心管中，加3 mL 30%氫碘酸80℃反應(yīng)2 h；冷卻后加入3 mL50% 乙醇，2 234 g離心10 min，取沉淀；向沉淀中加入1M NaOH，80℃反應(yīng)4 h，10 000 g離心10 min取上清350 nm下測樣品上清液和烏賊黑溶液的OD值。

10 mg毛樣中真黑素含量=（烏賊黑1mg/mL×樣品OD值）/烏賊黑OD值

褐黑素含量：30 mg毛樣剪成小段置于15 mL離心管中，加3 mL 0.1M PBS(pH10.5)；室溫劇烈混合后10 min,10 000 g離心10 min取上清，向上清液中加2 mL氯仿，振蕩均勻，4 000 r/min 10 min取黃色上清液；10 000 r/min 10 min取上清液；400 nm下檢測樣品和烏賊黑OD值。

10 mg毛羊中褐黑素含量=（烏賊黑1 mg/mL×樣品OD值）/烏賊黑OD值

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

對羊毛纖維中總黑色素、真黑色素和褐黑色素的含量用單因素方差分析檢測不同毛色之間的差異。用Pearson相關(guān)分析不同黑色素間的相關(guān)性[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同毛色中國美利奴（軍墾型）羊毛纖維的細(xì)度

不同毛色中國美利奴羊（軍墾型）肩胛部羊毛纖維直徑檢測結(jié)果如表1所示。從表中可以看出白色、灰色和棕黑色3組羊毛樣品中，羊毛纖維細(xì)度在18～20 μm之間。單因素ANOVA統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，不同毛色中國美利奴羊羊毛細(xì)度無顯著差異[11]（＞0.05）。

表1 不同毛色中國美利奴（軍墾型）羊毛細(xì)度

采用Pearson相關(guān)分析羊毛細(xì)度與毛色之間的關(guān)系（表2）。從表中可以看出，毛色與細(xì)度之間的相關(guān)系數(shù)為0.108（＞0.05），表明羊毛細(xì)度與羊毛顏色之間無顯著相關(guān)關(guān)系。本研究中所選擇的非白色羊毛個體均來自于中國美利奴羊（軍墾型）群體，羊毛細(xì)度檢測結(jié)果證明不同毛色個體的羊毛細(xì)度無差異，與樣本來源相符。

表2 羊毛細(xì)度與毛色Pearson相關(guān)性分析

2.2 不同毛色中國美利奴（軍墾型）羊毛纖維中黑色素的含量

本試驗中利用烏賊墨比色法分析了不同毛色中國美利奴（軍墾型）羊毛纖維黑色素的種類和含量（圖2）。對不同毛色分組比較羊毛中黑色素種類和含量檢測數(shù)據(jù)進行單因素ANOVA統(tǒng)計分析（表3）。結(jié)果顯示，ASM含量在不同組中的含量變化較大，白色羊毛中含量最少，黑色羊毛中的含量最多，組間存在極顯著的差異（＜0.01）。毛纖維中EM和PM變化趨勢與ASM相同且含量極顯著少于ASM（＜0.01），但不同毛色組間差異不顯著（＞0.05）。EM在羊毛中的含量也隨著羊毛顏色變深而增加，但各組間含量變化也未達(dá)到顯著水平（＞0.05）。PM在不同毛色的羊毛樣本中的含量很低，但白色個體中的變化水平相對穩(wěn)定且含量低于有色個體，棕黑色羊毛中PM含量是白色組的兩倍多（P＞0.05）。白色組中EM與PM總量占ASM含量的28.7%，在灰色和棕黑色組中的比例約為18%，EM和PM在ASM中的百分比值與羊毛顏色變化相反。

圖2 羊毛黑色素含量分析

表3 不同毛色中國美利奴（軍墾型）羊毛纖維黑色素含量[13]

采用Pearson相關(guān)分析羊毛顏色與黑色素種類和含量之間的關(guān)系 （表4）。結(jié)果顯示，羊毛纖維中ASM、EM和PM含量與毛色的深淺變化相一致，隨著毛色變深A(yù)SM、EM和PM含量呈現(xiàn)增加的趨勢，它們的含量變化與羊毛毛色之間呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系[14]（表4）。其中ASM與毛色之間表現(xiàn)為極顯著的高度正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)0.962，＜0.01），EM和PM含量與毛色表型間均表現(xiàn)為極顯著的強正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)0.570,0.585，＜0.01）。EM和PM占ASM中的百分比與羊毛顏色表現(xiàn)為顯著的強負(fù)相關(guān) （相關(guān)系數(shù)-0.547）。

表4 羊毛毛色與黑色素種類和含量的Pearson相關(guān)性分析

3 討論

羊毛中黑色素是由毛球中的黑色素細(xì)胞合成的。黑色素的合成過程中受到不同基因的調(diào)節(jié)最終形成真黑素和褐黑素，黑色素的含量及真/褐兩種黑色素的比例決定了羊毛的顏色，其中真黑素產(chǎn)生黑色至褐色的毛發(fā)，而褐黑素則對應(yīng)黃色至紅色的毛發(fā)?？茖W(xué)工作者研發(fā)了多種方法檢測皮膚和毛發(fā)中的黑色素。如拉曼光譜分析、皮膚反射光譜、電子自旋共振(ESR)光譜、化學(xué)裂解比色法和HPLC法等。化學(xué)裂解比色法和HPLC法均需要強堿處理樣品，無法在動物活體直接進行分析；其他幾種方法雖然可以實現(xiàn)無創(chuàng)傷的檢測但所需的儀器設(shè)備昂貴，而化學(xué)裂解比色法所需要儀器簡單，操作簡便，可被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)實踐中[15]。

利用HPLC和化學(xué)裂解比色法研究哺乳動物毛發(fā)中黑色素的含量和種類已有成功的應(yīng)用，大量的研究結(jié)果提示出哺乳動物毛色與毛纖維中黑色素的含量和種類有著密切的關(guān)系。如Aliev等[9]利用HPLC法檢測了羊毛中的黑色素類型及含量，無論是顯性黑還是隱性黑毛表型都與真黑素含量相關(guān)，而從棕到紅的表型則是由兩種黑色素的比例變化導(dǎo)致的。范瑞文等[7]利用烏賊黑比色法檢測了不同毛色駝毛纖維中黑色素的含量和種類。本研究以在中國美利奴育種群中發(fā)現(xiàn)的有色個體為研究對象，利用烏賊黑分光光度計比色法[7,8]分析了不同毛色羊毛樣本中黑色素含量和種類，證明羊毛纖維中黑色素的含量是影響羊毛顏色的決定因素。

與其他研究結(jié)果相似，不同顏色的中國美利奴羊毛纖維中褐黑素的含量極顯著地低于真黑素和堿性可溶性黑色素，有色中國美利奴羊毛表型以棕黑色為主，而褐黑素主要產(chǎn)生黃色至紅色的毛發(fā)，因此低濃度的褐黑素也與羊毛顏色相一致。Toth等[10]在研究馬毛色與黑色素含量間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，黑色素含量與馬灰毛表現(xiàn)出強烈的負(fù)線性關(guān)系（＜0.01），本試驗中發(fā)現(xiàn)在白色中國美利奴羊毛纖維中真黑素與褐黑素之和占堿性可溶性黑色素的比例高于棕黑色和灰色羊毛，但黑色素總量極顯著低于灰色和棕黑色組；灰色和棕黑色羊毛中真黑素與褐黑素總量占堿性可溶性黑色素的比例數(shù)相近，都表明堿性可溶性黑色素總量的多少決定了羊毛白與非白表型，而真黑素和褐黑素的含量則決定白色與非白羊毛纖維的顏色變化。

4 結(jié)論

本研究建立了基于烏賊黑比色法檢測中國美利奴羊毛纖維中黑色素含量和種類的方法，檢測了不同毛色中國美利奴（軍墾型）羊毛纖維細(xì)度及羊毛中黑色素的含量和種類，結(jié)果表明羊毛色變化與羊毛細(xì)度之間無相關(guān)性，羊毛黑色素含量和種類與羊毛纖維顏色有顯著的相關(guān)關(guān)系。隨著羊毛顏色的變深，羊毛纖維中三種黑色素含量增加。在非白色羊毛真黑素與褐黑素在ASM中的比例相對穩(wěn)定，白色羊毛中二者占ASM的比例高于非白色羊毛。研究結(jié)果提示黑色素對羊毛顏色的形成是一個比較復(fù)雜的過程，羊毛纖維中ASM含量與羊毛顏色的深淺有關(guān)，真黑素和褐黑素在羊毛黑色素中的比例則可能與羊毛的白色與非白色表型相關(guān)。