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        高效液相色譜法測定酚酞片中的7個雜質(zhì)

        2019-10-16 09:07:08聶忠莉趙樹敏王曉玲趙玉玲蕭茂玲成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院四川成都6006成都克萊蒙醫(yī)藥科技有限公司四川成都6004
        關(guān)鍵詞:酚酞結(jié)果表明雜質(zhì)

        聶忠莉, 趙樹敏, 王曉玲, 趙玉玲, 張 勇, 蕭茂玲(.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院, 四川 成都 6006; .成都克萊蒙醫(yī)藥科技有限公司, 四川 成都 6004)

        0 引 言

        酚酞片主要成分是酚酞[1],臨床上常用于治療習(xí)慣性頑固性便秘.酚酞為刺激性傾瀉性,主要作用于大腸,口服后在腸道堿性環(huán)境中形成可溶性鈉鹽,刺激腸壁內(nèi)神經(jīng)叢,直接作用于腸道平滑肌,使腸蠕動增加.同時酚酞又抑制腸道內(nèi)水分的吸收,使水和電解質(zhì)在結(jié)腸蓄積,產(chǎn)生緩瀉作用,其作用與腸中堿性大小有關(guān),且其作用溫和,很少引起腸道痙攣[2].

        酚酞的制作主要由鄰苯二甲酸酐和苯酚反應(yīng)合成.相關(guān)研究表明,酚酞在合成過程中,未完全反應(yīng)的起始原料、反應(yīng)的中間體、反應(yīng)副產(chǎn)物和分解產(chǎn)物以及參與反應(yīng)的試劑可能引入雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G、雜質(zhì)H、雜質(zhì)I及雜質(zhì)J 10種雜質(zhì),分別為鄰苯二甲酸酐、苯酚、熒光母素、2-羥基蒽醌、2-(4-羥基苯甲酰)苯甲酸、1-羥基蒽醌、酚酞啉、鄰苯二甲酸、芴和苯酞[3].《中國藥典》2015年版二部[4]收載酚酞片的雜質(zhì)檢查項是采用薄層色譜法控制熒光母素的限度[5-6].本實驗是采用高效液相色譜法對酚酞片中可能存在的7個已知雜質(zhì)(包括雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G及雜質(zhì)I)含量進行控制研究,結(jié)果表明該方法具有合理性和有效性.

        1 材料與儀器

        1.1 材 料

        實驗所用材料包括:鄰苯二甲酸酐(雜質(zhì)A)(批號,906637-LJC0Q81,含量為99.79%)、芴(雜質(zhì)I)(批號,334723-L8809,含量為98%),購自北京百靈威科技有限公司;熒光母素(雜質(zhì)C)(批號,100075-201303,含量為100%),購自中國食品藥品檢定研究院;2-(4-羥基苯甲酰)苯甲酸(雜質(zhì)E)(批號,F(xiàn)CC17197,含量為98.97%)、1-羥基蒽醌(雜質(zhì)F)(批號,F(xiàn)CB044533,含量為95%),購自英國Fluorochem公司;2-羥基蒽醌(雜質(zhì)D)(批號,IBQBD-FAH1012,含量為97.4%)、酚酞啉(雜質(zhì)G)(批號,18095-LVSKC-CB,含量為99.1%),購自東京化成工業(yè)株式會社;酚酞片(批號,20170904、170802、180501、180502、180503,規(guī)格為50 mg/0.1 g),購自四川省通園制藥有限公司;乙腈為色譜純,其余試劑均為分析純,水為純化水.

        1.2 儀 器

        實驗所用儀器包括:1410高效液相色譜儀(日立(中國)有限公司),BP-210D型精密電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司,756CRT型紫外分光光度計(上海佑科儀器儀表有限公司),Kelisonic超聲清洗儀(深圳市科力超聲波洗凈設(shè)備有限公司).

        2 方法與結(jié)果

        2.1 溶液的配制

        2.1.1 各雜質(zhì)貯備液的制備.

        精密稱取雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G及雜質(zhì)I對照品適量,于100 mL容量瓶中加乙腈溶解并稀釋至刻度,制成1 mL中含各雜質(zhì)0.5 mg的乙腈溶液,作為各雜質(zhì)貯備液.

        2.1.2 定位溶液.

        取各雜質(zhì)貯備液200 μL加乙腈稀釋至1 mL作為定位溶液.

        2.2 色譜條件

        實驗的色譜條件為:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,以0.01 mol/L磷酸氫二甲溶液的0.1%醋酸水溶液—乙腈(90∶10)為流動相A,0.01mol/L磷酸氫二甲溶液的0.1%醋酸水溶液—乙腈(30∶70)為流動相B,進行梯度洗脫,洗脫條件[7]見表1;檢測波長為270 nm,柱溫40 ℃,流速1.0 mL/min.

        表1 洗脫條件表

        2.3 系統(tǒng)適用性

        精密稱取酚酞片(批號,20170904)細粉約11.23 mg,置10 mL的量瓶中,再另取“2.1”項下雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G及雜質(zhì)I貯備液各40 μL同置上述10 mL量瓶中,加乙腈至刻度,搖勻,即為系統(tǒng)適用性溶液.精密量取20 μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖如圖1所示.

        圖1 系統(tǒng)適用性實驗色譜圖

        由圖1可知,雜質(zhì)E、雜質(zhì)A、雜質(zhì)G、酚酞、雜質(zhì)D、雜質(zhì)F、雜質(zhì)C及雜質(zhì)I依次出峰,主峰及各雜質(zhì)峰保留時間的RSD均小于1.0%,峰面積的RSD小于2.0%,雜質(zhì)峰之間的分離度均遠大于1.5,拖尾因子也在較好范圍內(nèi),表明本方法系統(tǒng)適用性好,可進一步進行研究.

        2.4 酚酞片提取條件的選擇

        精密稱取酚酞片(批號,170802)細粉約15 mg,共3份,分別置于10 mL量瓶中,加乙腈適量,分別超聲處理1、2、5 min,放冷后定容.各取2 mL離心(轉(zhuǎn)速為10 000 r/min)10 min,得上清液,另取2 mL用0.45 μm有機濾膜過濾,得續(xù)濾液,精密量取上清液、續(xù)濾液各20 μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖.結(jié)果表明,6種提取方法的結(jié)果基本一致,故任選一種作為酚酞片提取處理的方法,即超聲處理1 min后,再離心(轉(zhuǎn)速為10 000 r/min)10 min,得上清液,作為本片測定的供試品溶液.

        2.5 定量限、檢測限

        取“2.1”項下各雜質(zhì)貯備液,分別加乙腈稀釋至系列濃度的供試品溶液,按照“2.2”項下的色譜條件,分別精密量取20 μL進行測定,計算當(dāng)各雜質(zhì)響應(yīng)值約為基線噪音的3倍和10倍時的進樣量,結(jié)果計算出,雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G及雜質(zhì)I的定量限分別為25.194 ng、9.881 ng、0.721 ng、6.899 ng、3.863 ng、11.989 ng、5.433 ng;檢測限分別為8.755 ng、2.430 ng、0.201 ng、3.265 ng、1.157 ng、3.965 ng、2.979 ng.

        取相當(dāng)于定量限濃度的供試品溶液,連續(xù)進樣6次,考察其重現(xiàn)性.結(jié)果表明,各峰保留時間RSD值均小于0.1%,峰面積RSD值均小于5.0%,表明重現(xiàn)性較好.

        2.6 專屬性

        取酚酞片細粉(批號,170802),分別進行高溫、氧化、酸、堿及光照破壞實驗,考察各雜質(zhì)的降解情況.結(jié)果表明,空白溶劑無干擾;破壞產(chǎn)生的雜質(zhì)與主峰,以及雜質(zhì)與雜質(zhì)之間分離度均在1.5以上,能達到完全分離,主峰峰純度均達到0.999,雜質(zhì)峰峰純度基本均達0.99以上;各破壞樣品的物料平衡均在98%~117%之間.實驗表明,該方法專屬性良好,能檢測出本品在儲藏和運輸過程的極端條件下產(chǎn)生的降解產(chǎn)物.

        2.7 線性關(guān)系

        取“2.1”項下各雜質(zhì)貯備液用乙腈逐級稀釋得到系列雜質(zhì)溶液,考察其濃度與峰面積的線性關(guān)系.結(jié)果表明,在1 μg/mL~23 μg/mL的濃度范圍內(nèi),各雜質(zhì)峰面積與樣品濃度呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均達到0.999.

        2.8 回收率

        分別精密稱取酚酞片(批號,170802)細粉約15 mg,共10份,其中1份置10 mL量瓶中,加乙腈適量,超聲1 min,用乙腈稀釋至刻度,搖勻,離心(轉(zhuǎn)速為10 000 r/min)10 min后,得上清液,作為供試品空白溶液.另9份分別分成3組,分別加入“2.1”項下各雜質(zhì)貯備液20 μL、40 μL、60 μL,每組3份,加乙腈適量,超聲1 min,用乙腈稀釋至刻度,搖勻,離心(轉(zhuǎn)速為10 000 r/min)10 min后,得上清液,分別作為回收率50%、100%、150%的供試品溶液.分別精密量取20 μL,注入液相色譜儀.另精密量取“2.1”項下各雜質(zhì)貯備液0.8 mL于200 mL容量瓶中,加乙腈至刻度稀釋成1 mL中含各雜質(zhì)2 μg的溶液,作為對照品溶液,同法測定.計算供試品溶液中各雜質(zhì)的含量,并扣除酚酞中各雜質(zhì)的含量,計算回收率.結(jié)果表明,雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G及雜質(zhì)I 7個雜質(zhì)的平均回收率分別為101.94%、103.02%、101.63%、100.87%、100.98%、99.11%、101.67%,RSD值分別為1.47%、2.31%、1.76%、1.06%、1.15%、0.74%、1.38%,表明了在該條件下,各雜質(zhì)的回收率良好,準確度高.

        2.9 重復(fù)性

        精密稱取酚酞片(批號,170802)細粉6份,每份約15 mg,置10 mL量瓶中,分別精密加入“2.1”項下各雜質(zhì)貯備液40 μL,加乙腈適量,超聲1 min,用乙腈稀釋至刻度,搖勻,離心(轉(zhuǎn)速為10 000 r/min)10 min后,得上清液,作為供試品溶液.分別精密量取20 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖.另精密量取“2.1”項下各雜質(zhì)貯備液0.8 mL,加乙腈稀釋成1 mL中含各雜質(zhì)2 μg的溶液,作為對照品溶液,同法測定.計算6份樣品中各雜質(zhì)的含量,并計算RSD.結(jié)果表明,雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G及雜質(zhì)I 7個雜質(zhì)的RSD值分別為3.81%、1.57%、1.38%、1.57%、1.96%、1.51%、3.81%,表明本方法的重復(fù)性好.

        2.10 中間精密度

        由不同分析人員在不同時間,采用不同儀器對同一批樣品的6份供試品溶液進行測定.結(jié)果表明,雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G及雜質(zhì)I 7個雜質(zhì)的RSD值分別為4.16%、4.90%、4.95%、1.75%、1.84%、4.78%、3.85%,表明中間精密度良好.

        2.11 穩(wěn)定性

        以回收率項下的100%-1#溶液,作為供試品溶液.分別在0、13、17、36 h注入液相色譜儀,記錄不同時刻樣品中各雜質(zhì)的峰面積,并計算RSD.結(jié)果表明,雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G及雜質(zhì)I 7個雜質(zhì)的RSD值分別為0.76%、1.29%、1.13%、1.03%、1.32%、2.32%、1.30%,表明了在36 h內(nèi)溶液的穩(wěn)定性良好.

        2.12 耐用性

        精密稱取酚酞片(批號,170802)細粉約15 mg,置10 mL量瓶中,分別精密加入“2.1”項下各雜質(zhì)貯備液40 μL,加乙腈適量,超聲1 min,用乙腈稀釋至刻度,搖勻,離心(轉(zhuǎn)速為10 000 r/min)10 min后,得上清液,作為供試品溶液.量取“2.1”項下各雜質(zhì)貯備液40 μL,用乙腈溶解稀釋至10 mL作為對照品溶液.分別精密量取上述溶液各20 μL,在柱溫、流速、色譜柱及檢測波長等進行微小變動的條件下,進樣測定,記錄色譜圖,按外標法計算各雜質(zhì)的含量,并計算RSD.結(jié)果表明,雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G及雜質(zhì)I 7個雜質(zhì)的RSD值分別為4.21%、4.90%、4.81%、2.90%、2.72%、4.83%、3.87%,表明本方法耐用性良好.

        2.13 樣品測定

        取酚酞片細粉約15 mg,精密稱定,置10 mL量瓶中,加乙腈適量,超聲1 min,用乙腈稀釋至刻度,搖勻,離心(轉(zhuǎn)速為10 000 r/min)10 min后,得上清液,作為供試品溶液.另取各雜質(zhì)雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G及雜質(zhì)I適量,加乙腈制成1 mL各含雜質(zhì)2 μg混合溶液作為對照品溶液.分別精密量取上述各溶液20 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖.供試品溶液色譜圖中如有與對照品溶液色譜圖中雜質(zhì)峰保留時間一致的峰,按外標法計算各雜質(zhì)的含量,含各雜質(zhì)應(yīng)不得過0.1%.各批樣品檢測結(jié)果見表2.

        表2 各批樣品檢測結(jié)果

        由表2可知,2個規(guī)格共6批樣品均只檢出有關(guān)雜質(zhì)C,且雜質(zhì)C的含量均小于0.1%,均未檢出其他有關(guān)雜質(zhì)和未知雜質(zhì),因此2個規(guī)格共6批樣品結(jié)果符合規(guī)定.

        3 討 論

        本研究采用可見—紫外分光光度計,在200~400 nm波長范圍內(nèi)掃描,對各雜質(zhì)的吸收波長進行了考察.結(jié)果表明,雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G、雜質(zhì)H、雜質(zhì)I及雜質(zhì)J在220 nm、250 nm、270 nm波長處均有吸收,綜合各雜質(zhì)看,每個雜質(zhì)在270 nm波長處有最大吸收,所以將各雜質(zhì)的測定波長擬定在270 nm波長處.

        由于雜質(zhì)D、雜質(zhì)F及雜質(zhì)I在各批樣品中均未檢出,在穩(wěn)定性考察過程中也未見增加趨勢,所以僅作研究,未收載入質(zhì)量標準.雜質(zhì)C在各批樣品中均可檢出,雜質(zhì)A、雜質(zhì)E及雜質(zhì)G在堿破壞條件下均有產(chǎn)生,所以將雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)E和雜質(zhì)G收載入質(zhì)量標準,限度為不得過0.1%.

        本研究通過對雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G及雜質(zhì)I測定方法進行了方法學(xué)研究,其專屬性、定位試驗、系統(tǒng)適用性、定量限、檢測限、回收率、重復(fù)性、中間精密度、穩(wěn)定性及耐用性均達到良好的效果,表明所采用的分析方法是科學(xué)的、合理的,并能有效控制酚酞片中各雜質(zhì)的含量.《中國藥典》2015年版二部收載的酚酞片質(zhì)量標準中,僅對熒光母素(雜質(zhì)C)的含量進行限度控制,采用的是薄層色譜法,而本研究中采用高效液相色譜法對雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G及雜質(zhì)I進行含量控制,該測定方法優(yōu)于現(xiàn)行藥典中給出的相關(guān)檢測方法.

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