廖惠云,王 瑞,張 華,吳 洋,曹 毅,張 媛,王晨輝
江蘇中煙工業(yè)有限責任公司,南京市建鄴區(qū)興隆大街29 號 210019
苯并[a]芘(B[a]P)是行業(yè)關注的卷煙煙氣7 種代表性有害成分之一[1-5]。在量化分析煙氣B[a]P過程中,由于復雜煙氣成分帶來的干擾,加之目標物在煙氣中的釋放量處于納克級的水平,特別是低焦油卷煙煙氣中目標物的釋放量可能更低。因此,如何有效去除卷煙煙氣復雜基質的干擾,快速、準確測定其中的B[a]P 是煙氣分析研究的熱點[6-8]。
相較于現(xiàn)行國標GB/T 21130—2007[9]的方法,有不少科研工作者對其量化分析進行優(yōu)化研究,比如周仕祿等[10]、史佳沁等[11]、邊照陽等[12]、尉朝等[13]、王春蘭等[14]、段沅杏等[15]、陳曉水等[16]、王晶等[17]、申欽鵬等[18]先后對樣品前處理過程或質譜儀器進行改進完善,以期達到簡化樣品前處理、提高分析準確度的目的。其中為了提高操作效率,采用氣相色譜-串聯(lián)質譜(GC-MS/MS)方法,將樣品萃取液直接進樣分析成為一種技術選擇,但實際驗證結果表明,受基質效應影響,目標物的回收率偏低??陀^說來,這些分析方法對于大批量樣品的快速、準確測定仍有待完善之處。因此,在參考相關文獻[19-21]的基礎上,建立了采用基質匹配溶劑配制標準溶液,樣品萃取溶液直接進樣,使用GC-MS/MS 測定卷煙主流煙氣B[a]P 釋放量的方法,旨在為卷煙煙氣中痕量B[a]P 的定量分析提供方法參考。
18 個不同盒標焦油量的市售卷煙(其中1#~5#樣品為細支卷煙,6#~18#樣品為常規(guī)圓周卷煙);卷煙煙氣分析用1#標準樣品。
環(huán)己烷、甲醇、二氯甲烷(色譜純,德國CNW公司);氘代苯并[a]芘(B[a]P-d12)、苯并[a]芘(標準品,≥98%,德國Dr.Ehrenstorfer 公司);500 mg/6 mL 硅膠固相萃取柱(上海安譜科學儀器有限公司)。
6890N/5975C 氣相色譜-質譜聯(lián)用儀、7890A/7000B 氣相色譜-三重串聯(lián)四極桿質譜聯(lián)用儀(美國Agilent 公司);RM 20H 全自動吸煙機(德國Borgwaldt KC 公司);HY-5A 回旋振蕩器(常州國華電器有限公司);KQ-500DE 超聲波發(fā)生器(昆山市超聲儀器有限公司);R-215 旋轉蒸發(fā)儀(瑞士Büchi 公司);T201 電子天平(感量0.000 1 g,瑞士Mettler Toledo 公司)。
1.2.1 標準工作溶液的配制
(1)內(nèi)標溶液和標準儲備液
準確稱取內(nèi)標物B[a]P-d12,使用環(huán)己烷為溶劑配制濃度為320 ng/mL 的內(nèi)標溶液;準確稱取目標物B[a]P,使用環(huán)己烷為溶劑配制濃度為200 ng/mL 的標準儲備液。
(2)基質匹配溶劑
按GB/T 19609—2004[22]的要求收集20 支卷煙煙氣分析用1#標準樣品的煙氣總粒相物,添加40 mL 環(huán)己烷,于振蕩器上160 r/min 條件下萃取40 min,靜置片刻,得萃取液。在對萃取液進行處理前,先對固相萃取柱進行活化,即用5 mL 甲醇進行淋洗,排干,再用10 mL 環(huán)己烷平衡,柱子篩板上保留少量環(huán)己烷。然后用活化好的固相萃取柱制備基質匹配溶劑,即準確移取10 mL 萃取液至活化好的固相萃取柱,待萃取液全部移至固相萃取柱的填料后,先用環(huán)己烷分3 次、每次10 mL 進行淋洗,再用二氯甲烷分3 次、每次10 mL 進行淋洗,棄去淋洗液;最后用10 mL 甲醇進行洗脫,收集洗脫液,視為基質匹配溶劑。
(3)標準工作溶液
分別準確移取標準儲備液50、100、200、500 和1 000 μL,以及內(nèi)標溶液各250 μL,用基質匹配溶劑稀釋定容至10 mL 容量瓶中。該系列標準工作溶液B[a]P 濃度分別為1、2、4、10 和20 ng/mL,其中內(nèi)標B[a]P-d12濃度為8 ng/mL。
1.2.2 樣品處理與分析
按照GB/T 16450—2004[23]的要求收集20 支卷煙的總粒相物。將收集有20 支卷煙總粒相物的玻璃纖維濾片放入100 mL 錐形瓶中(濾片應整片放入錐形瓶內(nèi)鋪平,不能剪碎或撕碎),準確移入1 mL 內(nèi)標溶液于濾片上,并移入40 mL 環(huán)己烷,置于振蕩器上于160 r/min 條件下萃取40 min,靜置片刻。將萃取液過0.45 μm 有機相濾膜,將濾液直接進行GC-MS/MS 分析。分析條件為:
色譜柱:HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進樣口溫度:280 ℃;進樣量:2 μL;進樣方式:脈沖不分流進樣,進樣壓力172.37 kPa,持續(xù)時間0.75 min;載氣:氦氣,恒流速度1.2 mL/min;程序升溫℃(20 min);傳輸線溫度:280 ℃;電離方式:EI 源,正離子模式;離子源溫度:300 ℃;四極桿溫度:均為180 ℃;碰撞氣:氮氣,流速1.5 mL/min,載氣(氦氣)流速2.25 mL/min;多反應監(jiān)測(MRM)模式,詳細參數(shù)見表1。
前期驗證實驗表明,使用環(huán)己烷作配標溶劑、應用GC-MS/MS 分析B[a]P 時,受基質效應影響,煙氣中目標物的回收率偏低。因此,基質效應是采用MS 法分析煙氣中B[a]P 時必須考慮的問題?;|效應通常不能被消除,但一般可采用SPE凈化、稀釋樣品提取液、采用合適的內(nèi)標、標準加入法以及配制基質匹配標準溶液等[24]措施來減小其對量化分析的影響。對比現(xiàn)行國標方法[9]采取的措施,本著簡化樣品前處理過程的目的,本研究中采用配制基質匹配標準溶液的方法來減小基質效應的影響,具體思路為:使用硅膠固相萃取柱凈化樣品溶液時,上樣液和淋洗液經(jīng)接收合并、濃縮后用于MS 分析,而樣品溶液中其余物質被吸附保留在固相萃取柱中,理論上被視為干擾基質。在盡可能與樣品溶液中目標物存在的基質環(huán)境保持一致情況下,該部分物質經(jīng)洗脫下來,再經(jīng)稀釋后制成基質匹配溶劑,用于配制基質匹配標準溶液。
表1 目標物的MRM 參數(shù)Tab.1 MRM parameters of B[a]P and B[a]P-d12
圖1 不同淋洗條件下B[a]P 的提取離子對色譜圖Fig.1 Ion-pairs chromatograms of B[a]P under different eluent volume conditions
為此,先行考察B[a]P 在硅膠固相萃取柱的保留行為,以期制備合適的基質匹配溶劑。具體過程為:按照1.2 節(jié)的方法,參照GB/T 21130—2007[9]的方法加入30 mL 環(huán)己烷進行淋洗,收集淋洗液并濃縮至1 mL,溶液中目標物的色譜圖見圖1a;再用二氯甲烷分4 次、每次10 mL 進行淋洗,分別收集淋洗液并濃縮至1 mL,溶液中目標物色譜圖見圖1b~圖1e。色譜圖1a~圖1e 中B[a]P 的峰面積依次為319 715、5 114、2 488、1 486 和0(因色譜圖1e中目標物的S/N 小于10,視為未檢出),可見使用30 mL 環(huán)己烷和30 mL 二氯甲烷才能使目標物被完全洗脫。理論上,B[a]P 的辛醇-水分配系數(shù)lg KOW為6.04,屬于非極性化合物,在硅膠固相萃取柱中是不易保留的。實際檢測結果表明,用環(huán)己烷淋洗后,B[a]P 在柱子中仍有少許保留。所以在制備基質匹配溶劑時,依次用30 mL 環(huán)己烷、30 mL 二氯甲烷為溶劑淋洗萃取液,棄去淋洗液,最后直接用10 mL 甲醇洗脫,收集全部洗脫液,視為基質匹配溶劑,用于配制標準工作溶液。
2.2.1 進樣方式優(yōu)選
基于煙氣中B[a]P 釋放水平及其在萃取液中的稀釋程度,為提高響應情況,在痕量分析中可加大進樣量來提高靈敏度。一般來講,溶劑在襯管內(nèi)氣化后有較大膨脹體積,普通壓力下進樣有體積限制。為此可使用脈沖模式,用以提高實際進入色譜柱的樣品量,使氣化后的樣品更多進入色譜柱進而提高檢測靈敏度;同時由于本方法中采用了脈沖進樣,使得進樣口壓力變大,在溶劑膨脹體積和襯管體積允許條件下,將進樣量由通常的1 μL 改為2 μL。在保持其他條件不變的情況下,研究進樣方式對目標物響應的影響。圖2a~圖2d 依次為分流(分流比為10∶1)、脈沖分流(分流比為10∶1)、不分流及脈沖不分流等進樣方式下目標物出峰情況??梢钥闯觯? 種進樣方式下,B[a]P 出峰情況總體較好,峰形對稱,基線完全分離。相比于分流條件而言,不分流條件下目標物峰面積更大,同時信噪比也有一定程度提高。在不分流條件下,相比單純不分流而言,脈沖不分流條件下的目標物峰面積、信噪比均顯著提高。因此,考慮目標物整體出峰狀況,優(yōu)選脈沖不分流為色譜進樣方式。
圖2 進樣方式對B[a]P 出峰情況的影響Fig.2 Effect of injection mode on chromatogram peak of B[a]P
2.2.2 離子對及碰撞能量的確定
圖3 全掃描模式下B[a]P(a)和B[a]P-d12(b)的質譜圖Fig.3 Mass spectra of B[a]P(a)and B[a]P-d12(b)under full scan mode
以高濃度標準工作溶液為對象,通過全掃描模式選擇合適的母離子,B[a]P 和B[a]P-d12的質譜圖如圖3 所示??梢钥闯?,B[a]P 分子離子(也就是其基峰離子)為m/z 252,B[a]P-d12分子離子(也就是其基峰離子)為m/z 264。因此,分別選擇m/z 252 和m/z 264 為B[a]P 和B[a]P-d12的母離子。進一步分析,由于B[a]P 極性很小、結構非常穩(wěn)定,不同碰撞能量產(chǎn)生的質譜圖差異較大,因此在5~60 eV 碰撞能量范圍條件下,采用產(chǎn)物離子掃描模式進行檢測,以此優(yōu)選產(chǎn)物離子及其碰撞能量。結果顯示:碰撞能量小于30 eV 時,相對于母離子豐度,B[a]P 產(chǎn)生碎片離子的豐度均小于其10%;碰撞能量大于30 eV 時,B[a]P 母離子產(chǎn)生碎片離子豐度顯著增大,特別是碰撞能量大于40 eV 時,母離子更大程度被打碎,產(chǎn)生的基峰離子為m/z 250。綜合考慮各離子響應情況,確定B[a]P 的定量離子為m/z 250,輔助定性離子為m/z 226,各自優(yōu)化的碰撞能量分別為50 eV 和30 eV。同理,可確定B[a]P-d12定量離子為m/z 260,輔助定性離子為m/z 236,各自優(yōu)化的碰撞能量分別為50 eV 和40 eV。
2.2.3 質譜溫度參數(shù)優(yōu)選
考慮到最低基質配標工作溶液中B[a]P 濃度僅為1 ng/mL,當質譜儀器離子源和四極桿為常用溫度時,目標物響應值低且峰形不好,對B[a]P的定量分析有一定影響。為此,以1 ng/mL 最低標樣溶液為對象,探討高離子源和四極桿溫度(分別為300、180 ℃)以及常用溫度條件下目標物出峰情況,具體結果見圖4 和圖5。可以看出,相比于常用溫度質譜參數(shù),高溫質譜參數(shù)下B[a]P 和B[a]P-d12的背景信號稍微有所增加,但目標物峰形總體情況更好,峰形對稱且不拖尾,信噪比提高,響應信號增強。綜合考慮質譜儀器離子源溫度極限值,兼顧離子源使用壽命以及定量分析結果的準確性,優(yōu)選離子源和四極桿溫度分別為300 ℃和180 ℃。
2.3.1 萃取液處理過程優(yōu)選
圖4 不同質譜溫度條件下B[a]P 的提取離子對色譜圖Fig.4 Ion-pairs chromatograms of B[a]P at different mass temperatures
圖5 不同質譜溫度條件下B[a]P-d12的提取離子對色譜圖Fig.5 Ion-pairs chromatograms of B[a]P-d12 at different mass temperatures
對于卷煙主流煙氣B[a]P 的分析而言,因其釋放量較低,需經(jīng)過富集和分離等過程,易對檢測結果帶來影響?;诖?,充分利用GC-MS/MS 儀器MRM 采集模式下復雜基質中目標物響應靈敏的特點,直接采用萃取溶液進行儀器分析,得到的典型樣品溶液色譜圖如圖6a 所示。可以看出,B[a]P 峰形對稱,能夠與基線完全分離,基線噪聲趨近于零,雜質干擾峰較少。采用現(xiàn)行國標方法[9]得到的色譜圖(圖6b),B[a]P 峰形對稱,能夠與基線完全分離,但是基線噪聲較大,雜質干擾峰較多,信噪比相較本方法更低。由此可見,在采用GC-MS/MS 法分析時,即使直接使用萃取液進樣,目標物依然能夠精確定量,并且整體出峰情況優(yōu)于現(xiàn)行國標方法。更為重要的是,樣品前處理大為簡便,無需對萃取液進行凈化、濃縮等過程,節(jié)省了有機溶劑。
圖6 不同前處理條件下B[a]P 的總離子流色譜圖Fig.6 TIC chromatogram of B[a]P under different sample processing conditions
2.3.2 提取方式選擇
按照現(xiàn)行國標方法[9]進行B[a]P 分析,采用超聲萃取進行提取時,隨提取時間的延長,超聲波發(fā)生器內(nèi)水溫升高,受環(huán)己烷沸點低的影響,錐行瓶內(nèi)氣相壓力增大,給前處理操作帶來負面影響。為此,以15#卷煙樣品為對象,使用GC-MS/MS 方法,將萃取溶液直接進樣檢測分析,比較了超聲和振蕩兩種萃取方法對檢測結果的影響,結果見表2??梢钥闯觯S萃取時間的延長,兩種萃取方式對B[a]P 檢測結果影響的變化趨勢較為一致,即先逐漸增大,到40~50 min 左右趨于峰值。綜合考量檢測結果和操作效率,選擇提取方式為振蕩萃取,萃取時間為40 min。
表2 萃取方式對B[a]P 檢測結果的影響Tab.2 Influence of extraction method on results of B[a]P detection (ng·支-1)
將系列標準溶液進行GC-MS/MS 分析,求得線性回歸方程及其相關參數(shù)?;貧w方程為Y=1.56X-0.010,決定系數(shù)R2為0.999 6,目標物在1.04~20.8 ng/mL 濃度范圍內(nèi)呈線性關系。以基質配標得到的最低濃度標樣為對象,平行測定9 次,求其標準偏差;分別以3 倍和10 倍標準偏差對應的結果為方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),計算得LOD 和LOQ 分別為0.14 ng/支和0.46 ng/支,結果顯示本方法比現(xiàn)行國標方法[9]更為靈敏。
分別以不同盒標焦油量的1#和6#卷煙樣品為對象,依次進行日內(nèi)精密度和日間精密度實驗,計算6 次平行測定結果的相對標準偏差(RSD),結果如表3 所示。可以看出,本方法的日內(nèi)RSD 介于3.13%~3.80%之間,日間RSD 介于5.41%~6.94%之間。在含有目標物的玻璃纖維濾片中分別加入低、中、高3 個水平的標準溶液,進行加標回收實驗,結果見表4??梢钥闯觯?、中、高3 個水平的加標回收率在94.62%~104.81%之間。本方法具有較好的精密度和準確度,能夠滿足煙氣中痕量目標物的定量分析。
表3 方法的精密度Tab.3 Precision of the method
表4 方法的回收率Tab.4 Recoveries of the method
分別采用本方法和現(xiàn)行國標方法測定了18 個不同盒標焦油量的細支和常規(guī)卷煙樣品主流煙氣B[a]P 釋放量,結果見表5。可以看出,相比于現(xiàn)行國標方法,本方法檢測結果的相對偏差均在±10%以內(nèi)。采用SPSS 軟件對兩種方法的測定結果進行配對t 檢驗,結果表明,選取置信度為95%時,Sig.=0.216(>0.05),說明兩種方法的測定結果不存在顯著性差異。由此可見,對于痕量目標物的定量分析而言,兩種方法的一致性較好。
表5 不同盒標主流煙氣焦油釋放量卷煙樣品的實際檢測結果Tab.5 Determination results of cigarette samples with different labeled tar levels from mainstream smoke
①采用樣品萃取溶液直接進樣方式,建立了基質匹配曲線-GC-MS/MS 法快速測定卷煙主流煙氣B[a]P 的方法,回收率為94.62%~104.81%,RSD 介于3.13%~6.94%之間,檢出限為0.14 ng/支,定量限為0.46 ng/支。②樣品對比分析表明,本方法與現(xiàn)行國標方法的測定結果基本一致。③本方法具有操作簡便、耗費溶劑少、靈敏度高等優(yōu)點,為準確、快速測定卷煙主流煙氣B[a]P 釋放量提供了新方法。