氯化鈣對(duì)酸雨脅迫下烤煙葉片表觀特征和葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/h1>
2019-10-15 11:39:40徐宗藝陳泉印黃雨萌孫廣玉
煙草科技 2019年9期
徐宗藝，陳泉印，米 良，黃雨萌，王 月，孫廣玉
東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱市香坊區(qū)和興路26 號(hào) 150040
天然降水通常受溶解的二氧化碳影響，其pH一般為5.6 左右［1］。而隨著城鎮(zhèn)的工業(yè)化發(fā)展，對(duì)化石燃料能源的需求量日益增加，同時(shí)燃燒過(guò)程中向大氣排放氮和硫的氧化物也越來(lái)越多，直接導(dǎo)致大氣酸沉降增加［2-3］。目前，酸沉降已成為世界三大環(huán)境問(wèn)題之一［3-5］。近年來(lái)，隨著中國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，受酸雨濕沉降影響的土地面積逐年擴(kuò)大，危害越來(lái)越嚴(yán)重［6］。長(zhǎng)期及過(guò)量的大氣酸沉降對(duì)生態(tài)系統(tǒng)及人體健康具有較大的危害性，而在整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)中，植物是酸沉降污染的主要受體［7］。酸沉降會(huì)腐蝕植物體表皮、造成植物體內(nèi)的酶和葉綠素部分失活、膜質(zhì)過(guò)氧化、自由基平衡遭受破壞，植物抵抗環(huán)境脅迫的能力降低［4，8-14］。鈣不僅是植物必需的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素，而且可作為細(xì)胞內(nèi)生理生化反應(yīng)的第二信使偶聯(lián)胞外信號(hào)。因此，可以通過(guò)穩(wěn)定細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)并誘導(dǎo)特定基因的表達(dá)來(lái)提高植物體的抗逆性［15-18］。通過(guò)施加外源鈣提高植物抗性的方法已在小麥、玉米、苜蓿、龍眼和番茄等作物，以及水果和蔬菜上得到應(yīng)用［19-23］?？緹熓俏覈?guó)重要的葉用經(jīng)濟(jì)作物，而已有的烤煙在逆境脅迫下的研究主要集中在細(xì)胞膜透性、氣候斑的形成以及抗病性等方面［24-25］，對(duì)烤煙光合機(jī)構(gòu)的研究報(bào)道較少，尤其在烤煙受酸雨脅迫后施加外源鈣的研究方面尚鮮見(jiàn)報(bào)道。為此，以烤煙品種龍江911 為材料，通過(guò)檢測(cè)煙草葉片表觀傷害、吸收光能能力、電子傳遞速率及PSⅡ供體側(cè)、受體側(cè)和反應(yīng)中心活性，以及檢測(cè)光合碳同化能力等，研究酸雨濕沉降對(duì)植物葉片光合機(jī)構(gòu)造成的傷害，明確在酸雨脅迫條件下施加外源氯化鈣的緩解作用，旨在為酸雨頻發(fā)地區(qū)的烤煙栽培管理提供依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
供試烤煙品種為龍江911，由黑龍江省煙草科學(xué)研究所提供。試驗(yàn)在東北林業(yè)大學(xué)植物生理實(shí)驗(yàn)室酸雨棚中進(jìn)行。采用傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)缽育苗，待烤煙幼苗長(zhǎng)至4葉1心時(shí)，移栽至直徑15 cm、高20 cm的培養(yǎng)缽中，每缽定植1 株，以草炭土∶蛭石=2∶1（體積比）的混合物作為培養(yǎng)基質(zhì)。在溫度25 ℃/23 ℃（光/暗）、光照強(qiáng)度400 μmol·m-2·s-1、光周期12 h/12 h（光/暗）、相對(duì)濕度75%的人工氣候箱中培養(yǎng)，每周澆灌1 次稀釋1 倍的Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液。待幼苗長(zhǎng)到6 葉1 心時(shí)選取長(zhǎng)勢(shì)一致的煙苗進(jìn)行酸雨處理。
1.2 試驗(yàn)處理
設(shè)置模擬酸雨溶液處理組pH 2.5、pH 3.5、pH 4.5 和pH 5.5 共4 個(gè)。依據(jù)黑龍江省的酸雨類型并參照有關(guān)研究報(bào)道［26］，按［SO42-］和［NO3-］比例為1∶3，配制酸雨母液。同時(shí)配制電解質(zhì)母液（pH 7.0），主要離子成分及濃度為31.46 mg/L NaF、26.28 mg/L KCl、74.91 mg/L CaCl2、171.28 mg/L MgSO4和82.27 mg/L NH4Cl。通過(guò)稀釋1 000 倍電解質(zhì)母液將酸雨母液酸度調(diào)整至pH 2.5、pH 3.5、pH 4.5 和pH 5.5 的模擬酸雨，以清水為對(duì)照（CK）。將制備的測(cè)試溶液儲(chǔ)存在棕色玻璃試劑瓶中并標(biāo)記。模擬酸雨采用噴霧法噴灑，用500 mL 園藝噴霧器每天噴1 次，每次對(duì)烤煙葉片正反面均勻噴灑至葉尖流下細(xì)密的液滴為止，連續(xù)噴7 d，在每天7：00—8：00 進(jìn)行噴灑處理，為避免相互干擾，在不同處理間用塑料薄膜將植株分離，噴灑酸雨后第2 天澆水。
在pH 2.5 處理組煙株葉片出現(xiàn)癥狀后噴施10 mmol·L-1CaCl2溶液（pH 7.0）。均勻噴施在葉片的正面和背面，噴在葉片上的CaCl2溶液形成細(xì)霧狀的小液珠欲滴為止。待葉片表面的水分自然蒸發(fā)，CaCl2溶液完全被吸收后，再重復(fù)噴施1 次，每次噴施量相同。
1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法
葉片受害率測(cè)定：用目測(cè)的方法來(lái)評(píng)估葉片受害等級(jí)，見(jiàn)表1。
葉綠素a 熒光參數(shù)的測(cè)定：于9：00—11：00 時(shí)通過(guò)多功能植物效率分析儀（M-PEA，英國(guó)漢莎公司）測(cè)定每處理組中長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)一致的烤煙煙苗。將煙苗的第2片完全展開葉（從上往下數(shù)）進(jìn)行30 min的暗適應(yīng)后，測(cè)量葉片的初始熒光（Fo）、最大熒光（Fm）、電 子 傳遞 速率（ETR）、光 合 性 能 指 數(shù)（PIABS）；光化學(xué)反應(yīng)集聚能量（ABS/RC），QA氧化還原反應(yīng)消耗能量（TRo/RC），光化學(xué)反應(yīng)中心捕獲的用于電子傳遞能量（ETo/RC）和光化學(xué)反應(yīng)消耗能量（DIo/RC）。利用脈沖調(diào)制式熒光儀（FMS-2，英國(guó)漢莎公司）測(cè)量經(jīng)過(guò)30 min 暗適應(yīng)后第3 片完全展開葉的用于光化學(xué)反應(yīng)量子產(chǎn)額（ΦPSII），類囊體膜兩側(cè)質(zhì)子梯度和葉黃素循環(huán)介導(dǎo)的量子產(chǎn)額（ΦNPQ），基本的熒光量子產(chǎn)額和熱耗散量子產(chǎn)額（Φf，D）以及光化學(xué)反應(yīng)失活熱耗散量子產(chǎn)額（ΦNF）。
表1 植株葉片受害等級(jí)的劃分Tab.1 Damage classification of plant leaves
1.4 數(shù)據(jù)處理
采用Microsoft Office Excel Statistical Package（Microsoft Office Excel，2013）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；采用One-Way ANOVA 分析和t 檢驗(yàn)進(jìn)行處理組與對(duì)照組的均值及差異顯著性檢驗(yàn)，顯著性水平為P＜0.05。
2 結(jié)果與分析
2.1 酸雨脅迫下氯化鈣對(duì)烤煙葉片表觀特性的影響
由圖1 可見(jiàn)，不同pH 模擬酸雨濕沉降對(duì)烤煙葉片可造成不同程度的傷害。受害癥狀主要表現(xiàn)為葉緣與葉脈間產(chǎn)生黃棕色和黑褐色不規(guī)則的斑塊，頂端幼葉卷曲、皺縮。pH 5.5 酸雨處理的葉片無(wú)可見(jiàn)性傷害；pH 4.5 酸雨處理的葉片表現(xiàn)出輕微傷害，部分烤煙葉片中出現(xiàn)失綠斑點(diǎn)，受害等級(jí)為I；pH 3.5 酸雨處理導(dǎo)致葉片出現(xiàn)局部深紅色斑點(diǎn)和壞死斑點(diǎn)，斑點(diǎn)直徑約0.2 cm，受害面積約占總?cè)~面積的20%，受害等級(jí)為Ⅱ。pH 2.5 酸雨處理造成葉片傷害最為嚴(yán)重，有80%以上的煙苗葉片上有傷斑出現(xiàn)，受害等級(jí)為IV。施加外源氯化鈣可減少酸雨脅迫對(duì)烤煙葉片造成的表觀傷害，葉片上失綠斑點(diǎn)減少。
圖1 酸雨脅迫下施加外源鈣對(duì)烤煙葉片表觀特性的影響Fig.1 Effects of exogenous CaCl2 on phenotype characteristics of flue-cured tobacco leaves under acid rain stress
2.2 酸雨脅迫下氯化鈣對(duì)烤煙葉片F(xiàn)o、Fm、PIABS和ETR 的影響
圖2 表明，模擬酸雨濕沉降處理改變了烤煙幼苗葉片的Fo、Fm、PIABS和ETR。與CK 相比，pH 5.5 處理組的Fo、Fm和ETR 分別增加8.02%、4.39%和5.52%；而pH≤4.5 處理組的Fo、Fm、PIABS和ETR與CK 相比則顯著降低，說(shuō)明重度酸雨抑制了烤煙葉片PSⅡ光化學(xué)反應(yīng)，降低PSII 最初光能轉(zhuǎn)換效率以及電子傳遞速率，抑制光合作用的原初反應(yīng)過(guò)程。而在酸雨脅迫下噴施氯化鈣溶液處理組葉 片 的Fo、Fm和PIABS顯 著 增 加，CK 和pH 5.5 時(shí)ETR 增加不明顯，pH≤4.5 時(shí)ETR 增加顯著，說(shuō)明烤煙葉片噴施外源鈣能夠增加PSⅡ反應(yīng)中心的活性。
2.3 酸雨脅迫下氯化鈣對(duì)烤煙葉片ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC 和ETo/RC 的影響
圖2 酸雨脅迫下氯化鈣對(duì)烤煙葉片F(xiàn)o、Fm、PIABS和ETR 的影響Fig.2 Effects of exogenous CaCl2 on Fo，F(xiàn)m，PIABS and ETR of flue-cured tobacco leaves under acid rain stress
圖3 酸雨脅迫下氯化鈣對(duì)烤煙幼苗葉片ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC 和ETo/RC 的影響Fig.3 Effects of exogenous CaCl2 on ABS/RC，DIo/RC，TRo/RC and ETo/RC of flue-cured tobacco leaves under acid rain stress
模擬酸雨濕沉降處理顯著提高了烤煙幼苗葉片的ABS/RC，DIo/RC 和TRo/RC，且酸雨pH越低，增加幅度越明顯，見(jiàn)圖3。圖3 表明，酸雨脅迫減少了烤煙葉片PS Ⅱ反應(yīng)中心的數(shù)量，而剩余光化學(xué)反應(yīng)集聚的能量和QA氧化還原反應(yīng)消耗的能量增加。在酸雨脅迫下，pH≥3.5 時(shí)施加外源氯化鈣后烤煙葉片DIo/RC顯著增加。其中CK、pH 5.5、pH 4.5 和pH 3.5處 理 組 分 別 增 加17.32%（P＜0.05）、6.64%（P＜0.05）、6.48%（P＜0.05）和8.92%（P＜0.05），說(shuō) 明施加外源鈣可增加烤煙葉片PS Ⅱ單位反應(yīng)中心耗散的能量。
2.4 酸雨脅迫下氯化鈣對(duì)烤煙葉片PSⅡ反應(yīng)中心吸收光能分配參數(shù)的影響
由 表2 可見(jiàn)，與CK 相比，pH 5.5 和pH 4.5 模擬酸雨濕沉降處理組烤煙葉片ΦPSⅡ有所增加，而ΦNPQ分 別 增 加8.49%和6.42%，ΦNF分 別 降 低64.71%和52.94%；pH 3.5 和pH 2.5 處理組烤煙葉片ΦPSⅡ分別降低25.47%和27.33%，與對(duì)照間差異達(dá)到顯著水平。說(shuō)明pH≤3.5 的模擬酸雨濕沉降使更多的PSⅡ反應(yīng)中心失活，PSⅡ的實(shí)際光化學(xué)效率降低。而酸雨脅迫下施用外源氯化鈣后，烤煙葉片ΦPSⅡ和Φf，D顯著增加，PSⅡ的實(shí)際光化學(xué)效率提高。
表2 酸雨脅迫下氯化鈣對(duì)烤煙葉片PSⅡ光化學(xué)反應(yīng)吸收光能分配參數(shù)的影響①Tab.2 Effects of exogenous CaCl2 on photochemical parameters of PSⅡsystem in flue-cured tobacco leaves under acid rain stress
3 討論
本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，pH≤4.5 模擬酸雨濕沉降處理的烤煙幼苗葉片F(xiàn)o和Fm顯著降低，說(shuō)明此時(shí)伸展葉片的PSⅡ反應(yīng)中心在完全開放和完全關(guān)閉狀態(tài)時(shí)的葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)量均降低［27］。在施加外源氯化鈣后，PSⅡ反應(yīng)中心的開放程度提高以保障類囊體膜上光合電子的正常傳遞，從而產(chǎn)生同化力用于碳的同化，這可能與Ca 可維持類囊體膜的穩(wěn)定性有關(guān)。光合系統(tǒng)性能指數(shù)PIABS既可以反映原初光化學(xué)量子產(chǎn)額，也可反映出反應(yīng)中心的密度和電子在PSI 和PSⅡ間的傳遞情況，以及光系統(tǒng)的活性，敏感性大于最大光化學(xué)效率Fv/Fm［28-29］。因此，將PIABS作為煙草對(duì)酸雨反應(yīng)的有效熒光參數(shù)指標(biāo)。本試驗(yàn)中，pH≤4.5 模擬酸雨濕沉降處理葉片的PIABS顯著降低，進(jìn)一步說(shuō)明酸雨脅迫下誘導(dǎo)烤煙葉片電子傳遞受阻主要與PSⅡ受體側(cè)的功能被破壞有關(guān)。在酸雨脅迫下施加氯化鈣溶液后，處理組PIABS均顯著增加，說(shuō)明施加外源氯化鈣提高了烤煙幼苗葉片PSⅡ的電子傳遞速率。酸雨濕沉降處理后烤煙幼苗反應(yīng)中心的數(shù)量減少，迫使有活性的光化學(xué)反應(yīng)的功能增加，這是植物在逆境條件下自我保護(hù)機(jī)制作用的結(jié)果。葉片施加氯化鈣后，PSⅡ剩余活性中心的效率提高。
植物光能的利用情況可用實(shí)際光化學(xué)效率（ΦPSⅡ）和非光化學(xué)淬滅系數(shù)（NPQ）來(lái)表示［30-31］。但高等植物體中NPQ 的增加是由于類囊體膜兩側(cè)質(zhì)子梯度的建立和葉黃素的循環(huán)過(guò)程決定的［32］，NPQ 不能代表所有非光化學(xué)反應(yīng)的淬滅過(guò)程。除光化學(xué)反應(yīng)外，光呼吸、水-水循環(huán)和葉黃素循環(huán)等生理過(guò)程也會(huì)利用植物葉片吸收的光能［33-34］。因此，本試驗(yàn)中將植物葉片葉綠素的激發(fā)能分為葉片PSⅡ光化學(xué)反應(yīng)集聚的能量用于光化學(xué)反應(yīng)的量子產(chǎn)額（ΦPSⅡ）、基本的熒光量子產(chǎn)額和熱耗散的量子產(chǎn)額（Φf，D）、PSⅡ光化學(xué)反應(yīng)失活的熱耗散量子產(chǎn)額（ΦNF）以及類囊體膜兩側(cè)質(zhì)子梯度和葉黃素循環(huán)介導(dǎo)的量子產(chǎn)額（ΦNPQ）4 個(gè)部分。本研究中發(fā)現(xiàn)，pH≥4.5 模擬酸雨的濕沉降處理烤煙葉片ΦPSⅡ、ΦNPQ以及Φf，D均明顯增加，說(shuō)明輕度酸雨（pH≥4.5）處理有助于烤煙幼苗葉綠體中光誘導(dǎo)的質(zhì)子吸收在類囊體兩側(cè)H+濃度梯度的建立，即類囊體膜兩側(cè)存在△pH，促進(jìn)了葉綠體中ATP 合成，進(jìn)而增強(qiáng)了葉黃素循環(huán)介導(dǎo)的光保護(hù)機(jī)能［35］。與此同時(shí)，利用熱能的形式耗散掉過(guò)剩的光能，避免了光合電子傳遞鏈?zhǔn)艿竭^(guò)量激發(fā)能量的損壞，可減少過(guò)量激發(fā)能對(duì)PSⅡ反應(yīng)中心的傷害。ΦNF所占比例呈下降趨勢(shì)，表明輕度模擬酸雨濕沉降處理后PSⅡ反應(yīng)中心失活的比例下降。pH≤3.5 模擬酸雨濕沉降處理的烤煙幼苗葉片ΦPSⅡ和Φf，D所占比例下降，ΦNF所占比例顯著增加，說(shuō)明重度酸雨阻礙了葉綠體中ATP 的合成，抑制了葉黃素循環(huán)介導(dǎo)的光保護(hù)機(jī)能的發(fā)揮，PSⅡ反應(yīng)中心失活的比例大幅增加。葉片施加外源氯化鈣后，ΦPSⅡ和Φf，D增加，烤煙葉片用于光化學(xué)反應(yīng)的量子產(chǎn)額以及PSⅡ的實(shí)際光化學(xué)效率提高，進(jìn)而提高了煙草的光合效率。其原因：一是由于Ca2+能與類囊體膜中的磷脂分子結(jié)合，所形成的鈣鹽能維持膜的結(jié)構(gòu)與功能，以此增強(qiáng)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性［36］；二是Ca2+還能與天線色素CP29 蛋白結(jié)合，改變CP29 蛋白的構(gòu)象，并維持天線色素復(fù)合體的功能，避免蛋白復(fù)合體的脫離和解體［37］，從而保持光化學(xué)反應(yīng)的順利進(jìn)行。
4 結(jié)論
采用人工氣候箱培養(yǎng)煙苗，在酸雨棚中人工模擬酸雨脅迫條件下，pH 5.5 的輕度酸雨沒(méi)有影響葉片的表觀特征以及PSⅡ的結(jié)構(gòu)和功能，并且在某種程度上有利于幼苗的生長(zhǎng)；pH 4.5 的中度酸雨對(duì)葉片產(chǎn)生輕微的傷害，但光保護(hù)機(jī)制和PSⅡ反應(yīng)中心活性沒(méi)有被破壞；pH≤3.5 的重度酸雨使葉片枯黃、出現(xiàn)失綠斑點(diǎn)，葉片吸收光能能力下降，PSⅡ受體側(cè)的功能被破壞，電子傳遞受到抑制，葉綠體中ATP 合成的動(dòng)力降低，進(jìn)而影響了PSⅡ反應(yīng)中心的活性。而在酸雨脅迫條件下，葉面噴施10 mmol·L-1CaCl2溶液可增強(qiáng)光保護(hù)機(jī)能和提高光化學(xué)效率。
徐宗藝，陳泉印，米 良，黃雨萌，王 月，孫廣玉
東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱市香坊區(qū)和興路26 號(hào) 150040
天然降水通常受溶解的二氧化碳影響，其pH一般為5.6 左右［1］。而隨著城鎮(zhèn)的工業(yè)化發(fā)展，對(duì)化石燃料能源的需求量日益增加，同時(shí)燃燒過(guò)程中向大氣排放氮和硫的氧化物也越來(lái)越多，直接導(dǎo)致大氣酸沉降增加［2-3］。目前，酸沉降已成為世界三大環(huán)境問(wèn)題之一［3-5］。近年來(lái)，隨著中國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，受酸雨濕沉降影響的土地面積逐年擴(kuò)大，危害越來(lái)越嚴(yán)重［6］。長(zhǎng)期及過(guò)量的大氣酸沉降對(duì)生態(tài)系統(tǒng)及人體健康具有較大的危害性，而在整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)中，植物是酸沉降污染的主要受體［7］。酸沉降會(huì)腐蝕植物體表皮、造成植物體內(nèi)的酶和葉綠素部分失活、膜質(zhì)過(guò)氧化、自由基平衡遭受破壞，植物抵抗環(huán)境脅迫的能力降低［4，8-14］。鈣不僅是植物必需的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素，而且可作為細(xì)胞內(nèi)生理生化反應(yīng)的第二信使偶聯(lián)胞外信號(hào)。因此，可以通過(guò)穩(wěn)定細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)并誘導(dǎo)特定基因的表達(dá)來(lái)提高植物體的抗逆性［15-18］。通過(guò)施加外源鈣提高植物抗性的方法已在小麥、玉米、苜蓿、龍眼和番茄等作物，以及水果和蔬菜上得到應(yīng)用［19-23］?？緹熓俏覈?guó)重要的葉用經(jīng)濟(jì)作物，而已有的烤煙在逆境脅迫下的研究主要集中在細(xì)胞膜透性、氣候斑的形成以及抗病性等方面［24-25］，對(duì)烤煙光合機(jī)構(gòu)的研究報(bào)道較少，尤其在烤煙受酸雨脅迫后施加外源鈣的研究方面尚鮮見(jiàn)報(bào)道。為此，以烤煙品種龍江911 為材料，通過(guò)檢測(cè)煙草葉片表觀傷害、吸收光能能力、電子傳遞速率及PSⅡ供體側(cè)、受體側(cè)和反應(yīng)中心活性，以及檢測(cè)光合碳同化能力等，研究酸雨濕沉降對(duì)植物葉片光合機(jī)構(gòu)造成的傷害，明確在酸雨脅迫條件下施加外源氯化鈣的緩解作用，旨在為酸雨頻發(fā)地區(qū)的烤煙栽培管理提供依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
供試烤煙品種為龍江911，由黑龍江省煙草科學(xué)研究所提供。試驗(yàn)在東北林業(yè)大學(xué)植物生理實(shí)驗(yàn)室酸雨棚中進(jìn)行。采用傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)缽育苗，待烤煙幼苗長(zhǎng)至4葉1心時(shí)，移栽至直徑15 cm、高20 cm的培養(yǎng)缽中，每缽定植1 株，以草炭土∶蛭石=2∶1（體積比）的混合物作為培養(yǎng)基質(zhì)。在溫度25 ℃/23 ℃（光/暗）、光照強(qiáng)度400 μmol·m-2·s-1、光周期12 h/12 h（光/暗）、相對(duì)濕度75%的人工氣候箱中培養(yǎng)，每周澆灌1 次稀釋1 倍的Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液。待幼苗長(zhǎng)到6 葉1 心時(shí)選取長(zhǎng)勢(shì)一致的煙苗進(jìn)行酸雨處理。
1.2 試驗(yàn)處理
設(shè)置模擬酸雨溶液處理組pH 2.5、pH 3.5、pH 4.5 和pH 5.5 共4 個(gè)。依據(jù)黑龍江省的酸雨類型并參照有關(guān)研究報(bào)道［26］，按［SO42-］和［NO3-］比例為1∶3，配制酸雨母液。同時(shí)配制電解質(zhì)母液（pH 7.0），主要離子成分及濃度為31.46 mg/L NaF、26.28 mg/L KCl、74.91 mg/L CaCl2、171.28 mg/L MgSO4和82.27 mg/L NH4Cl。通過(guò)稀釋1 000 倍電解質(zhì)母液將酸雨母液酸度調(diào)整至pH 2.5、pH 3.5、pH 4.5 和pH 5.5 的模擬酸雨，以清水為對(duì)照（CK）。將制備的測(cè)試溶液儲(chǔ)存在棕色玻璃試劑瓶中并標(biāo)記。模擬酸雨采用噴霧法噴灑，用500 mL 園藝噴霧器每天噴1 次，每次對(duì)烤煙葉片正反面均勻噴灑至葉尖流下細(xì)密的液滴為止，連續(xù)噴7 d，在每天7：00—8：00 進(jìn)行噴灑處理，為避免相互干擾，在不同處理間用塑料薄膜將植株分離，噴灑酸雨后第2 天澆水。
在pH 2.5 處理組煙株葉片出現(xiàn)癥狀后噴施10 mmol·L-1CaCl2溶液（pH 7.0）。均勻噴施在葉片的正面和背面，噴在葉片上的CaCl2溶液形成細(xì)霧狀的小液珠欲滴為止。待葉片表面的水分自然蒸發(fā)，CaCl2溶液完全被吸收后，再重復(fù)噴施1 次，每次噴施量相同。
1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法
葉片受害率測(cè)定：用目測(cè)的方法來(lái)評(píng)估葉片受害等級(jí)，見(jiàn)表1。
葉綠素a 熒光參數(shù)的測(cè)定：于9：00—11：00 時(shí)通過(guò)多功能植物效率分析儀（M-PEA，英國(guó)漢莎公司）測(cè)定每處理組中長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)一致的烤煙煙苗。將煙苗的第2片完全展開葉（從上往下數(shù)）進(jìn)行30 min的暗適應(yīng)后，測(cè)量葉片的初始熒光（Fo）、最大熒光（Fm）、電 子 傳遞 速率（ETR）、光 合 性 能 指 數(shù)（PIABS）；光化學(xué)反應(yīng)集聚能量（ABS/RC），QA氧化還原反應(yīng)消耗能量（TRo/RC），光化學(xué)反應(yīng)中心捕獲的用于電子傳遞能量（ETo/RC）和光化學(xué)反應(yīng)消耗能量（DIo/RC）。利用脈沖調(diào)制式熒光儀（FMS-2，英國(guó)漢莎公司）測(cè)量經(jīng)過(guò)30 min 暗適應(yīng)后第3 片完全展開葉的用于光化學(xué)反應(yīng)量子產(chǎn)額（ΦPSII），類囊體膜兩側(cè)質(zhì)子梯度和葉黃素循環(huán)介導(dǎo)的量子產(chǎn)額（ΦNPQ），基本的熒光量子產(chǎn)額和熱耗散量子產(chǎn)額（Φf，D）以及光化學(xué)反應(yīng)失活熱耗散量子產(chǎn)額（ΦNF）。
表1 植株葉片受害等級(jí)的劃分Tab.1 Damage classification of plant leaves
1.4 數(shù)據(jù)處理
采用Microsoft Office Excel Statistical Package（Microsoft Office Excel，2013）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；采用One-Way ANOVA 分析和t 檢驗(yàn)進(jìn)行處理組與對(duì)照組的均值及差異顯著性檢驗(yàn)，顯著性水平為P＜0.05。
2 結(jié)果與分析
2.1 酸雨脅迫下氯化鈣對(duì)烤煙葉片表觀特性的影響
由圖1 可見(jiàn)，不同pH 模擬酸雨濕沉降對(duì)烤煙葉片可造成不同程度的傷害。受害癥狀主要表現(xiàn)為葉緣與葉脈間產(chǎn)生黃棕色和黑褐色不規(guī)則的斑塊，頂端幼葉卷曲、皺縮。pH 5.5 酸雨處理的葉片無(wú)可見(jiàn)性傷害；pH 4.5 酸雨處理的葉片表現(xiàn)出輕微傷害，部分烤煙葉片中出現(xiàn)失綠斑點(diǎn)，受害等級(jí)為I；pH 3.5 酸雨處理導(dǎo)致葉片出現(xiàn)局部深紅色斑點(diǎn)和壞死斑點(diǎn)，斑點(diǎn)直徑約0.2 cm，受害面積約占總?cè)~面積的20%，受害等級(jí)為Ⅱ。pH 2.5 酸雨處理造成葉片傷害最為嚴(yán)重，有80%以上的煙苗葉片上有傷斑出現(xiàn)，受害等級(jí)為IV。施加外源氯化鈣可減少酸雨脅迫對(duì)烤煙葉片造成的表觀傷害，葉片上失綠斑點(diǎn)減少。
圖1 酸雨脅迫下施加外源鈣對(duì)烤煙葉片表觀特性的影響Fig.1 Effects of exogenous CaCl2 on phenotype characteristics of flue-cured tobacco leaves under acid rain stress
2.2 酸雨脅迫下氯化鈣對(duì)烤煙葉片F(xiàn)o、Fm、PIABS和ETR 的影響
圖2 表明，模擬酸雨濕沉降處理改變了烤煙幼苗葉片的Fo、Fm、PIABS和ETR。與CK 相比，pH 5.5 處理組的Fo、Fm和ETR 分別增加8.02%、4.39%和5.52%；而pH≤4.5 處理組的Fo、Fm、PIABS和ETR與CK 相比則顯著降低，說(shuō)明重度酸雨抑制了烤煙葉片PSⅡ光化學(xué)反應(yīng)，降低PSII 最初光能轉(zhuǎn)換效率以及電子傳遞速率，抑制光合作用的原初反應(yīng)過(guò)程。而在酸雨脅迫下噴施氯化鈣溶液處理組葉 片 的Fo、Fm和PIABS顯 著 增 加，CK 和pH 5.5 時(shí)ETR 增加不明顯，pH≤4.5 時(shí)ETR 增加顯著，說(shuō)明烤煙葉片噴施外源鈣能夠增加PSⅡ反應(yīng)中心的活性。
2.3 酸雨脅迫下氯化鈣對(duì)烤煙葉片ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC 和ETo/RC 的影響
圖2 酸雨脅迫下氯化鈣對(duì)烤煙葉片F(xiàn)o、Fm、PIABS和ETR 的影響Fig.2 Effects of exogenous CaCl2 on Fo，F(xiàn)m，PIABS and ETR of flue-cured tobacco leaves under acid rain stress
圖3 酸雨脅迫下氯化鈣對(duì)烤煙幼苗葉片ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC 和ETo/RC 的影響Fig.3 Effects of exogenous CaCl2 on ABS/RC，DIo/RC，TRo/RC and ETo/RC of flue-cured tobacco leaves under acid rain stress
模擬酸雨濕沉降處理顯著提高了烤煙幼苗葉片的ABS/RC，DIo/RC 和TRo/RC，且酸雨pH越低，增加幅度越明顯，見(jiàn)圖3。圖3 表明，酸雨脅迫減少了烤煙葉片PS Ⅱ反應(yīng)中心的數(shù)量，而剩余光化學(xué)反應(yīng)集聚的能量和QA氧化還原反應(yīng)消耗的能量增加。在酸雨脅迫下，pH≥3.5 時(shí)施加外源氯化鈣后烤煙葉片DIo/RC顯著增加。其中CK、pH 5.5、pH 4.5 和pH 3.5處 理 組 分 別 增 加17.32%（P＜0.05）、6.64%（P＜0.05）、6.48%（P＜0.05）和8.92%（P＜0.05），說(shuō) 明施加外源鈣可增加烤煙葉片PS Ⅱ單位反應(yīng)中心耗散的能量。
2.4 酸雨脅迫下氯化鈣對(duì)烤煙葉片PSⅡ反應(yīng)中心吸收光能分配參數(shù)的影響
由 表2 可見(jiàn)，與CK 相比，pH 5.5 和pH 4.5 模擬酸雨濕沉降處理組烤煙葉片ΦPSⅡ有所增加，而ΦNPQ分 別 增 加8.49%和6.42%，ΦNF分 別 降 低64.71%和52.94%；pH 3.5 和pH 2.5 處理組烤煙葉片ΦPSⅡ分別降低25.47%和27.33%，與對(duì)照間差異達(dá)到顯著水平。說(shuō)明pH≤3.5 的模擬酸雨濕沉降使更多的PSⅡ反應(yīng)中心失活，PSⅡ的實(shí)際光化學(xué)效率降低。而酸雨脅迫下施用外源氯化鈣后，烤煙葉片ΦPSⅡ和Φf，D顯著增加，PSⅡ的實(shí)際光化學(xué)效率提高。
表2 酸雨脅迫下氯化鈣對(duì)烤煙葉片PSⅡ光化學(xué)反應(yīng)吸收光能分配參數(shù)的影響①Tab.2 Effects of exogenous CaCl2 on photochemical parameters of PSⅡsystem in flue-cured tobacco leaves under acid rain stress
3 討論
本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，pH≤4.5 模擬酸雨濕沉降處理的烤煙幼苗葉片F(xiàn)o和Fm顯著降低，說(shuō)明此時(shí)伸展葉片的PSⅡ反應(yīng)中心在完全開放和完全關(guān)閉狀態(tài)時(shí)的葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)量均降低［27］。在施加外源氯化鈣后，PSⅡ反應(yīng)中心的開放程度提高以保障類囊體膜上光合電子的正常傳遞，從而產(chǎn)生同化力用于碳的同化，這可能與Ca 可維持類囊體膜的穩(wěn)定性有關(guān)。光合系統(tǒng)性能指數(shù)PIABS既可以反映原初光化學(xué)量子產(chǎn)額，也可反映出反應(yīng)中心的密度和電子在PSI 和PSⅡ間的傳遞情況，以及光系統(tǒng)的活性，敏感性大于最大光化學(xué)效率Fv/Fm［28-29］。因此，將PIABS作為煙草對(duì)酸雨反應(yīng)的有效熒光參數(shù)指標(biāo)。本試驗(yàn)中，pH≤4.5 模擬酸雨濕沉降處理葉片的PIABS顯著降低，進(jìn)一步說(shuō)明酸雨脅迫下誘導(dǎo)烤煙葉片電子傳遞受阻主要與PSⅡ受體側(cè)的功能被破壞有關(guān)。在酸雨脅迫下施加氯化鈣溶液后，處理組PIABS均顯著增加，說(shuō)明施加外源氯化鈣提高了烤煙幼苗葉片PSⅡ的電子傳遞速率。酸雨濕沉降處理后烤煙幼苗反應(yīng)中心的數(shù)量減少，迫使有活性的光化學(xué)反應(yīng)的功能增加，這是植物在逆境條件下自我保護(hù)機(jī)制作用的結(jié)果。葉片施加氯化鈣后，PSⅡ剩余活性中心的效率提高。
植物光能的利用情況可用實(shí)際光化學(xué)效率（ΦPSⅡ）和非光化學(xué)淬滅系數(shù)（NPQ）來(lái)表示［30-31］。但高等植物體中NPQ 的增加是由于類囊體膜兩側(cè)質(zhì)子梯度的建立和葉黃素的循環(huán)過(guò)程決定的［32］，NPQ 不能代表所有非光化學(xué)反應(yīng)的淬滅過(guò)程。除光化學(xué)反應(yīng)外，光呼吸、水-水循環(huán)和葉黃素循環(huán)等生理過(guò)程也會(huì)利用植物葉片吸收的光能［33-34］。因此，本試驗(yàn)中將植物葉片葉綠素的激發(fā)能分為葉片PSⅡ光化學(xué)反應(yīng)集聚的能量用于光化學(xué)反應(yīng)的量子產(chǎn)額（ΦPSⅡ）、基本的熒光量子產(chǎn)額和熱耗散的量子產(chǎn)額（Φf，D）、PSⅡ光化學(xué)反應(yīng)失活的熱耗散量子產(chǎn)額（ΦNF）以及類囊體膜兩側(cè)質(zhì)子梯度和葉黃素循環(huán)介導(dǎo)的量子產(chǎn)額（ΦNPQ）4 個(gè)部分。本研究中發(fā)現(xiàn)，pH≥4.5 模擬酸雨的濕沉降處理烤煙葉片ΦPSⅡ、ΦNPQ以及Φf，D均明顯增加，說(shuō)明輕度酸雨（pH≥4.5）處理有助于烤煙幼苗葉綠體中光誘導(dǎo)的質(zhì)子吸收在類囊體兩側(cè)H+濃度梯度的建立，即類囊體膜兩側(cè)存在△pH，促進(jìn)了葉綠體中ATP 合成，進(jìn)而增強(qiáng)了葉黃素循環(huán)介導(dǎo)的光保護(hù)機(jī)能［35］。與此同時(shí)，利用熱能的形式耗散掉過(guò)剩的光能，避免了光合電子傳遞鏈?zhǔn)艿竭^(guò)量激發(fā)能量的損壞，可減少過(guò)量激發(fā)能對(duì)PSⅡ反應(yīng)中心的傷害。ΦNF所占比例呈下降趨勢(shì)，表明輕度模擬酸雨濕沉降處理后PSⅡ反應(yīng)中心失活的比例下降。pH≤3.5 模擬酸雨濕沉降處理的烤煙幼苗葉片ΦPSⅡ和Φf，D所占比例下降，ΦNF所占比例顯著增加，說(shuō)明重度酸雨阻礙了葉綠體中ATP 的合成，抑制了葉黃素循環(huán)介導(dǎo)的光保護(hù)機(jī)能的發(fā)揮，PSⅡ反應(yīng)中心失活的比例大幅增加。葉片施加外源氯化鈣后，ΦPSⅡ和Φf，D增加，烤煙葉片用于光化學(xué)反應(yīng)的量子產(chǎn)額以及PSⅡ的實(shí)際光化學(xué)效率提高，進(jìn)而提高了煙草的光合效率。其原因：一是由于Ca2+能與類囊體膜中的磷脂分子結(jié)合，所形成的鈣鹽能維持膜的結(jié)構(gòu)與功能，以此增強(qiáng)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性［36］；二是Ca2+還能與天線色素CP29 蛋白結(jié)合，改變CP29 蛋白的構(gòu)象，并維持天線色素復(fù)合體的功能，避免蛋白復(fù)合體的脫離和解體［37］，從而保持光化學(xué)反應(yīng)的順利進(jìn)行。
4 結(jié)論
采用人工氣候箱培養(yǎng)煙苗，在酸雨棚中人工模擬酸雨脅迫條件下，pH 5.5 的輕度酸雨沒(méi)有影響葉片的表觀特征以及PSⅡ的結(jié)構(gòu)和功能，并且在某種程度上有利于幼苗的生長(zhǎng)；pH 4.5 的中度酸雨對(duì)葉片產(chǎn)生輕微的傷害，但光保護(hù)機(jī)制和PSⅡ反應(yīng)中心活性沒(méi)有被破壞；pH≤3.5 的重度酸雨使葉片枯黃、出現(xiàn)失綠斑點(diǎn)，葉片吸收光能能力下降，PSⅡ受體側(cè)的功能被破壞，電子傳遞受到抑制，葉綠體中ATP 合成的動(dòng)力降低，進(jìn)而影響了PSⅡ反應(yīng)中心的活性。而在酸雨脅迫條件下，葉面噴施10 mmol·L-1CaCl2溶液可增強(qiáng)光保護(hù)機(jī)能和提高光化學(xué)效率。
