朱衛(wèi)華，覃 煜，王成中

0 引言

呼吸機所致肺損傷(VILI)是急性肺損傷(ALI)及呼吸窘迫綜合征(ARDS)等患者接受機械通氣支持治療時最常見的并發(fā)癥，而其導(dǎo)致的不良反應(yīng)機制是因為較強的機械牽張應(yīng)力引起效應(yīng)細胞活化，從而產(chǎn)生大量的炎癥因子促使肺損傷[1-2]。姜黃素主要提取于姜科、天南星科等植物的根莖，外觀黃色，為酸性多酚類物質(zhì)，在生活中可作為色素及食品添加劑[3-4]。早期研究已證實姜黃素的藥理功效較多，在抗氧化、抗炎、抗病毒及抗腫瘤等方面發(fā)揮著重要作用[5-8]。也有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠改善肺泡上皮細胞炎性反應(yīng)及慢性阻塞性肺疾病[9-10]，但對機械牽張引發(fā)的Ⅱ型肺泡上皮細胞炎性損傷的保護作用研究較少。埃茲蛋白(ezrin)屬于一種膜骨架連接蛋白，而且其磷酸化水平與內(nèi)皮細胞通透性改變相關(guān)[11]；然而，Ⅱ型肺泡上皮細胞(AT-Ⅱ細胞)ezrin蛋白是否參與姜黃素對VILI損傷的保護作用國內(nèi)外尚未見研究。本文進一步研究姜黃素對VILI損傷導(dǎo)致的AT-Ⅱ細胞中ezrin/Akt信號通路及炎性因子的影響，以期為姜黃素的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料及方法

1.1 實驗大鼠 10～12周齡雄性SD大鼠(260～320 g)，購于北京維利通實驗動物中心。

1.2 主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco-BRL公司)；全氟丙烷(天津晶明新技術(shù)有限公司)；TNF-α、IL-1β及IL-6 ELISA試劑盒購自武漢華美生物公司；羊抗大鼠p-ezrin、ezrin、p-Akt和Akt抗體均購自英國Abcam公司；羊抗兔二抗及化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自美國Cell Signaling公司。BBS-DDC超凈工作臺(山東博科科學(xué)儀器有限公司)；LRH-150 BOD CO2細胞培養(yǎng)箱(上海印溪儀器表有限公司)；Victor3 1420 Multilable Counter 酶標儀(DX540，美國)；DYCZ-24DN凝膠電泳儀(北京六一儀器廠)；成像系統(tǒng)(BIO-RAD，美國)。

1.3 AT-Ⅱ細胞分離與培養(yǎng) 參考文獻[12]的方法對大鼠AT-Ⅱ細胞進行分離與培養(yǎng)。具體步驟如下：麻醉大鼠后采用PBS灌洗肺內(nèi)血液，并利用氣管插管向肺內(nèi)通氣數(shù)次，至肺呈蒼白色，再向肺內(nèi)灌注胰酶進行消化，清除肺門周圍結(jié)締組織，并快速剪碎組織及終止消化，4 ℃震蕩25 min，過80目、200目、280目不銹鋼篩過濾，離心收集細胞；用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸，用PBS、培養(yǎng)液清洗細胞1次，把細胞懸液加入制作IgG包被的培養(yǎng)皿，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)4 h，離心收集未黏附放入細胞，培養(yǎng)液清洗1次，堿性磷酸酶染色檢測AT-Ⅱ細胞純度，臺盼藍染色檢測細胞活力，然后進行后續(xù)實驗。

1.4 AT-Ⅱ細胞牽張刺激及藥物處理 取對數(shù)期細胞接種于6孔Bioflex彈性膜細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)48 h后，F(xiàn)lexercell 4000TM應(yīng)力加載系統(tǒng)施加20%的機械牽張應(yīng)力，頻率為30 r/min，時間分別為4、8、16、24、28 h。并且采用不同濃度姜黃素(10、20、30 μmol/L)分別處理細胞16、24 h后，檢測細胞中ezrin/Akt通路蛋白及培養(yǎng)液中炎性因子水平。

1.5 Western blot檢測p-ezrin、ezrin、p-Akt、Akt蛋白表達 機械牽張及不同濃度姜黃素處理細胞16 h后，收集細胞，加入裂解液在冰上充分裂解細胞30 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清，采用BCA法測定蛋白濃度。采用12%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入1∶1 000稀釋的p-ezrin、ezrin、p-Akt和Akt抗體4 ℃孵育過夜，再加入1∶3 000稀釋的二抗室溫孵育1.5 h，TBST清洗3次后ECL顯色曝光，Image J軟件分析蛋白灰度值。

1.6 ELISA檢測細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β及IL-6水平 收集細胞培養(yǎng)液，離心，收集上清。嚴格按照TNF-α、IL-1β及IL-6 ELISA試劑盒操作說明書檢測炎性因子水平。

2 結(jié)果

2.1 VILI誘導(dǎo)AT-Ⅱ細胞ezrin/Akt通路p-ezrin/ezrin、p-Akt/Akt蛋白表達量的動態(tài)變化 VILI刺激AT-Ⅱ細胞4、8、16、24、48 h后，采用Western blot檢測細胞中p-ezrin、ezrin、p-Akt、Akt蛋白表達水平的動態(tài)變化，如圖1。每種蛋白在對照組細胞中均有不同程度的表達。p-ezrin蛋白表達水平在VILI刺激16 h時表達量最高，8～24 h時保持高表達水平，刺激24 h后表達逐漸下降。p-Akt蛋白表達水平在VILI刺激4 h開始逐漸升高，在16 h表達水平升至最高，刺激24、48 h表達水平降低。但VILI刺激沒有改變ezrin、Akt的表達水平，相對于對照組差異沒有明顯變化。

圖1 VILI誘導(dǎo)下AT-Ⅱ細胞p-ezrin和p-Akt

2.2 姜黃素對VILI誘導(dǎo)下AT-Ⅱ細胞中p-ezrin和p-Akt蛋白表達的影響 根據(jù)上述p-ezrin和p-Akt蛋白表達的動態(tài)變化情況，采用VILI誘導(dǎo)AT-Ⅱ細胞16 h構(gòu)建模型。結(jié)果見圖2，VILI誘導(dǎo)組AT-Ⅱ細胞中p-ezrin和p-Akt蛋白表達水平相對于對照組顯著升高(P<0.05)。加入10、20、30 μmol/L姜黃素干預(yù)AT-Ⅱ細胞16 h后，均能夠不同程度地下調(diào)在VILI刺激下p-ezrin和p-Akt蛋白的表達，表現(xiàn)出劑量依賴性(P<0.05)。

圖2 姜黃素對p-ezrin和p-Akt蛋白表達的影響

注：1.對照組；2.VILI誘導(dǎo)組；3.VILI+10 μmol/L姜黃素；4.VILI+20 μmol/L姜黃素；5.VILI+30 μmol/L姜黃素。與對照組比較，*P<0.05；與VILI誘導(dǎo)組比較，#P<0.05

2.3 VILI誘導(dǎo)AT-Ⅱ細胞上清中TNF-α、IL-1β及IL-6水平的動態(tài)變化 ELISA分析了VILI誘導(dǎo)不同時間點AT-Ⅱ細胞上清中TNF-α、IL-1β及IL-6水平的動態(tài)變化，見圖3。TNF-α、IL-1β及IL-6在對照組細胞中均有分泌；VILI干預(yù)后，TNF-α、IL-1β及IL-6含量均有不同程度的升高。結(jié)果表明，在VILI刺激8 h內(nèi)，這3種炎性介質(zhì)的含量沒有發(fā)生明顯改變(P>0.05)；隨著刺激時間的進一步延長，在16、24、48 h時TNF-α、IL-1β及IL-6水平顯著升高(P<0.05)。

圖3 VILI誘導(dǎo)下AT-Ⅱ細胞上清炎性因子的動態(tài)變化

2.4 姜黃素對VILI誘導(dǎo)下AT-Ⅱ細胞上清中TNF-α、IL-1β及IL-6水平的影響 根據(jù)“2.3”項實驗結(jié)果，將VILI刺激時間確定為24 h。VILI刺激24 h，AT-Ⅱ細胞上清中TNF-α、IL-1β及IL-6水平均顯著增高(P<0.05)；加入10、20、30 μmol/L姜黃素干預(yù)AT-Ⅱ細胞24 h后，均能夠不同程度地抑制炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β及IL-6的分泌，表現(xiàn)出劑量依賴性(P<0.05)。見表1。

注：與對照組比較，*P<0.05；與VILI誘導(dǎo)組比較，#P<0.05

3 討論

機械通氣常用于ALI和ARDS等疾病的輔助支持治療，然而該手段也會帶來較多的并發(fā)癥，如肺損傷。目前對于VILI的發(fā)病機制存在不同的觀點，主要認為其不僅僅存在本身的機械損傷，還存在炎性介質(zhì)的參與[12]。肺的組成細胞較多，機械通氣過程會引起細胞空間位置的改變及細胞間的相互作用。AT-Ⅱ細胞是VILI損傷發(fā)生時主要的效應(yīng)細胞，較強的機械應(yīng)力會導(dǎo)致AT-Ⅱ細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進一步誘導(dǎo)其損傷。深入探討機械通氣時AT-Ⅱ細胞骨架及相關(guān)蛋白的變化對VILI損傷的認識有著重大意義。

ezrin蛋白是一種特異的膜骨架連接蛋白，主要表達于脊椎動物的上皮細胞。早期研究已證實,ezrin蛋白與細胞間黏附、連接、細胞遷移、細胞骨架構(gòu)建及腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移等關(guān)系密切[13-14]。ezrin蛋白活化時主要表現(xiàn)在羧基端蘇氨酸殘基磷酸化，會進一步激活下游Akt信號通路，誘發(fā)炎性反應(yīng)[15-16]。生理條件下，ezrin蛋白氨基端和羧基端形成分子內(nèi)或分子鍵交聯(lián)而處于失活狀態(tài)，當外界刺激(如TNF-α、晚期糖基化終產(chǎn)物及凝血酶)時會誘導(dǎo)其磷酸化而激活，進而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。研究還發(fā)現(xiàn),ezrin蛋白激活與臍靜脈、肺血管內(nèi)皮細胞損傷及通透性關(guān)系密切。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn),機械通氣能夠?qū)е路芜^度膨脹，引發(fā)肺內(nèi)炎癥反應(yīng)，進而促使AT-Ⅱ細胞損傷，引起肺上皮通透性升高及細胞功能破壞[17]。本文研究也發(fā)現(xiàn),機械牽張干預(yù)后，AT-Ⅱ細胞ezrin/Akt信號通路中p-ezrin及p-Akt蛋白表達水平顯著升高，而且細胞培養(yǎng)液中炎性因子TNF-α、IL-1β及IL-6的釋放量也明顯增高。

姜黃素是從姜黃屬植物根莖中提取的多酚類物質(zhì)，能夠通過改變細胞因子水平發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)。姜黃素在阿爾茨海默癥、肺間質(zhì)纖維化、動脈粥樣硬化等方面的應(yīng)用研究較多[18]。早期研究發(fā)現(xiàn),姜黃素能夠抑制炎性因子TNF-α、IL-1β及IL-6的產(chǎn)生，阻斷炎性通路的活化，起著較強的抗炎作用[19]，但其具體作用機制尚不清楚。本文采用姜黃素處理VILI細胞，進一步證實不同濃度姜黃素能夠抑制TNF-α、IL-1β及IL-6的釋放水平，并且下調(diào)ezrin/Akt信號通路中p-ezrin及p-Akt蛋白的表達。初步推斷姜黃素對VILI損傷具有保護作用，其機制可能與下調(diào)ezrin/Akt信號傳導(dǎo)來降低炎癥因子產(chǎn)生有關(guān)，為防治VILI損傷提供了新的研究方向。