周劍文，羅廣承，王新君，顏志堅

0 引言

尿路上皮癌(UBC)目前發(fā)病率已居于泌尿生殖道惡性腫瘤第2位,其中超過30%在首次診斷時已進入晚期，總體臨床預(yù)后仍較差[1]。對于尿路上皮癌晚期仍主要采用以順鉑(CDDP)為基礎(chǔ)的化療方案，但總體反應(yīng)率仍不足50%，而這可能與CDDP抵抗現(xiàn)象發(fā)生有關(guān)[2]，但目前為止，醫(yī)學(xué)界對于UBC患者CDDP抵抗形成機制尚未完全闡明。高遷移率族核小體結(jié)合域5(HMGN5)，也稱為NBP-45、GARP45或NSBP1，是2001年國外學(xué)者鑒定所得HMGN蛋白質(zhì)家族的最新成員[3]。近年來研究證實，HMGN5在各種人類腫瘤中呈過度表達，具有明顯致癌作用[4]。但該基因?qū)Π┘毎熋舾行杂绊懭源嬖跔幾h。已有研究顯示，HMGN5基因敲除可通過調(diào)節(jié)E-Cad和VEGF表達，干擾人UBC 5637細胞活性和侵襲性；而肌動蛋白和轉(zhuǎn)錄因子與CDDP抵抗發(fā)生有關(guān)；同時抑制VEGF-C表達亦能夠逆轉(zhuǎn)UBC細胞對順鉑的抵抗效應(yīng)[5-6]。本研究通過觀察HMGN5基因敲除對人膀胱上皮癌細胞CDDP化療敏感性的影響，旨在探索其具體作用機制，尋找潛在治療靶點，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)方法 人UBC 5637、Um-UC-3及T24細胞系均由長沙贏潤生物技術(shù)有限公司提供；細胞保存于RPMI 1640中，在恒溫(37 ℃)、5%CO2培養(yǎng)箱，同時添加胎牛血清。

1.2 轉(zhuǎn)染及給藥方法 轉(zhuǎn)染方法：長沙贏潤生物技術(shù)有限公司合成HMGN5(5′-GTT-GTT-GAA-GAC-TAC-AAT-3′)最有效shRNA序列，并將其克隆到pYr-LVsh載體形成針對HMGN5慢病毒載體；將UBC細胞接種于6孔板(5×104個細胞/孔)至細胞充分融合，再采用重組慢病毒感染細胞(50倍)，感染時間為24 h；繼續(xù)以RPMI-1640培養(yǎng)基和普氏霉素(1 μg/ml)替換培養(yǎng)基，以篩選陽性穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子；實驗中使用空白對照(未感染對照)證明未感染對照與shcontrol慢病毒轉(zhuǎn)染細胞間無顯著差異。

給藥方法：CDDP在無菌血清中梯度稀釋為0、1、2、4、8及16 μg/ml濃度，PI3K信號激活劑和胰島素樣生長因子-1由PeproTech提供并溶解于二甲基亞砜；使用配置好梯度濃度CDDP加入UBC細胞或感染慢病毒細胞，實施72 h劑量依賴性細胞增殖試驗，同時添加IGF-1(50 ng/ml)。

1.3 Western blot試驗 UBC細胞加入CDDP(6 μg/ml)處理，加或不加IGF-1(50 ng/ml)，采用溶解緩沖液溶解，參考文獻方法完成Western blot檢測；其中抗HMGN5抗體由Abcam提供(1∶1 000)，抗AKT抗體、磷酸化(P)-AKT抗體、Slug抗體、E-Cad抗體、VEGF-C抗體、細胞色素C抗體、裂解半胱天冬酶-3、裂解PARP及β-actin均由Cell Signaling Technology提供。

1.4 細胞增殖試驗 采用MTT試驗評估CDDP處理后細胞增殖水平；將細胞接種于96孔板(4×103個細胞/孔)上并采用梯度濃度CDDP處理；24 h后將MTT(5 mg/ml)在37 ℃添加至細胞處理4 h；繼續(xù)采用DMSO溶解活細胞形成紫藍色甲瓚晶體，490 nm波長下測量吸光度。

1.5 菌落形成試驗 轉(zhuǎn)染72 h后，細胞以400個/孔密度接種至6孔板；RPMI-1640培養(yǎng)基中加入CDDP(6 μg/ml)，加或不加IGF-1(50 ng/ml)，每隔3 d換液，連續(xù)2周；200倍光鏡下計數(shù)菌落(≥50個菌落)，室溫以純甲醇固定15 min，采用0.005%龍膽紫染色20 min。

1.6 細胞侵襲試驗 采用Transwell試驗評估細胞侵襲情況。每個Transwell插入物(孔徑8 μm)上部鋪有基底膠，接種含不同HMGN5表達水平膀胱癌5 637細胞(1×105個)；細胞在37 ℃溫度下培養(yǎng)于血清游離RPMI 1 640培養(yǎng)基，采用CDDP(6 μg/ml)和IGF 1(50 ng/ml)處理；培養(yǎng)24 h，細胞遷移后采用棉簽去除上腔黏附細胞，室溫下加入4%多聚甲醛固定表面細胞30 min，并繼續(xù)采用0.1%結(jié)晶紫染色20 min,采用200倍共焦顯微鏡計數(shù)。

1.7 細胞凋亡試驗 采用膜聯(lián)蛋白V-熒光素異硫氰酸鹽法檢測細胞凋亡狀態(tài)，試劑盒由南京科根生物技術(shù)有限公司提供；感染、CDDP(6 μg/ml)及IGF-1(50 ng/ml)處理24 h后，收集細胞以膜聯(lián)蛋白V和碘化丙烷暗室標記。采用BD流式細胞檢測細胞凋亡，并采用BD-Facsdiva 6.1.3軟件分析。

1.8 Hoechst 33342染色 轉(zhuǎn)染后24孔板上培養(yǎng)細胞，采用相同方法加CDDP和IGF-1(PI3K/Akt信號激活劑)處理，并繼續(xù)添加Hoechst 33342(1 μg/ml)；37 ℃下染色20～30 min；以冰PBS洗滌細胞2次，200倍熒光顯微鏡下觀察；凋亡細胞中可見濃稠熒光；凋亡細胞比例計算：5個隨機視野中凋亡細胞數(shù)/5個隨機視野中總細胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 HMGN55蛋白對UBC細胞CDDP敏感性的影響 Western blot試驗檢測UBC細胞株5637、t24及UM-UC-3中HMGN5蛋白表達，其中5637細胞系HMGN5蛋白水平最高，而UM-UC-3細胞中最低(P<0.05),見圖1A。采用細胞增殖MTT試驗檢測以上3種細胞系對于CDDP敏感性，其中5637細胞系對CDPP敏感性顯著高于其他2種(P<0.05)，且UM-UC-3細胞系敏感性最高,見圖1B。UBC細胞系HMGN5敲除后P-Akt表達顯著下降(P<0.05),見圖1C。

圖1 HMGN5蛋白對UBC細胞CDDP敏感性的影響

2.2 CDDP 劑量依賴性影響UBC細胞HMGN5表達 Western blot試驗結(jié)果中，CDDP對于HMGN5蛋白表達影響具有劑量依賴性方式；同時CDDP處理后P-Akt活性亦隨之降低(P<0.05),CDDP處理還可下調(diào)VEGF-C和SLUG表達，上調(diào)E-Cad表達(P<0.05)；此外，CDDP處理后細胞色素C、裂解半胱天冬酶-3及裂解半胱天冬酶表達均呈劑量依賴性上調(diào)(P<0.05),見圖2。

2.3 HMGN5基因敲除可增強5637細胞對CDDP治療敏感性 不同濃度(1～16 μg/ml)CDDP孵育24 h后，與陰性對照細胞相比，HMGN5基因敲除后5637細胞活力顯著下降(P<0.05),見圖3A。菌落形成分析結(jié)果提示，與單層培養(yǎng)14 d陰性對照細胞相比，HMGN5基因敲除后5637細胞形成菌落明顯減少(P<0.05)，而添加IGF-1后可在一定程度上增加菌落數(shù)(P<0.05),見圖3B、3C。HMGN5基因敲除后采用CDDP處理24 h，5637細胞基質(zhì)凝膠穿過數(shù)量顯著下降(P<0.05),見圖3D。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，5637細胞HMGN5基因敲除后早期凋亡率顯著提高，而加入IGF-1可逆轉(zhuǎn)這一過程(P<0.05),見圖3E。Hoechst 33342染色法結(jié)果顯示，與陰性對照組和IGF-1治療組相比，HMGN5敲除組凋亡核百分比顯著升高(P<0.05),見圖3F。Western blot試驗結(jié)果顯示，與對照組相比，HMGN5基因敲除顯著下調(diào)P-AKT和VEGF-C表達，上調(diào)E-Cad、細胞色素C、裂解半胱天冬酶-3、裂解PARP表達(P<0.05),而添加IGF-1可逆轉(zhuǎn)以上蛋白質(zhì)表達變化(P<0.05),見圖3G。

圖2 CDDP劑量依賴性影響UBC細胞HMGN5表達

圖3 HMGN5基因敲除影響5637細胞對CDDP治療的敏感性

3 討 論

HMGN5是HMGN蛋白質(zhì)家族的最新成員,已有研究顯示，HMGN5具有致癌效應(yīng)，但其在化療敏感性調(diào)節(jié)中作用仍未完全闡明[7]。既往報道認為，HMGN5可通過調(diào)節(jié)E-Cad和VEGF表達，加快UBC病情進展，而這可能與與腫瘤細胞對CDDP敏感性有關(guān)[8]。

本研究結(jié)果顯示，HMGN5能夠有效調(diào)節(jié)UBC細胞中P-Akt表達；同時HMGN5表達與UBC細胞對于順鉑敏感性呈負相關(guān)。以上均提示HMGN5基因可能是CDDP化療潛在治療靶點，這與CDDP可劑量依賴性下調(diào)HMGN5基因表達有關(guān)。此外，研究顯示，HMGN5基因敲除可降低5637細胞系存活率、集落形成及侵襲水平，但CD-DP治療后細胞凋亡量升高[9]。IGF-1是PI3K/Akt信號激活劑，其能夠逆轉(zhuǎn)5637細胞系因HMGN5基因敲除引起的改變[10]；隨著HMGN5基因表達水平降低，P-AKT、SLUG、E-Cad及VEGF-C表達同時受到抑制，而HMGN5基因敲除后細胞色素C、裂解半胱天冬酶3及裂解多聚ADP核糖聚合酶表達增加[11]。

國外學(xué)者報道顯示，骨肉瘤細胞系中，HMGN5均上調(diào)PI3KP85α和P-AKT表達，并可刺激腫瘤細胞惡性潛能[12-13]。本研究結(jié)果中，UBC 5637、T24及UM-UC-3細胞系敲除HMGN5基因后，P-Akt表達隨之降低，而Akt表達并未見明顯改變，說明HMGN5基因可能具有PI3K/AKT信號正調(diào)節(jié)效應(yīng)，筆者認為可能機制為HMGN5具有蛋白激酶效應(yīng)，可刺激Akt磷酸化，但HMGN5可能會放大PI3K催化亞單位轉(zhuǎn)錄水平[14]，故這一作用仍有待進一步探討。此外，PI3K/Akt信號還能夠調(diào)節(jié)EMT進展和VEGF-C表達，基于以上推測HMGN5能夠通過PI3K/Akt信號通路對E-Cad和VEGF水平進行調(diào)節(jié)。

化療是實體瘤臨床綜合治療重要組成部分，其療效與腫瘤細胞對化療藥物敏感性密切相關(guān)[15]。但目前有關(guān)HMGN5在調(diào)節(jié)化療敏感性方面研究爭議較大。部分學(xué)者研究顯示，抑制HMGN5基因可有效提高惡性腦膜瘤細胞對替莫唑胺誘導(dǎo)細胞毒性敏感性[16]；而在骨肉瘤細胞系中敲除HMGN5基因可通過激活凋亡信號通路增強阿霉素誘導(dǎo)細胞損傷敏感性[17]。但另一項研究顯示，HMGN5表達水平與前列腺癌細胞系對吉西他濱化療敏感性呈正相關(guān)，故高表達HMGN5基因可能提高化療效果[18]。MTT試驗結(jié)果顯示，與HMGN5基因表達水平較高的細胞相比，表達水平較低的UBC細胞對于CDDP治療敏感性更高；同時HMGN5基因敲除可顯著降低5637細胞系在CDDP治療過程中增殖、菌落形成及侵襲作用，故HMGN5基因表達較高的UBC細胞HMGN基因缺失可能提高腫瘤細胞對于CDDP治療敏感性。

已有研究顯示，PI3K/Akt信號通路異常激活在CDDP抵抗中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，抑制PI3K/Akt信號通路可增強CDPP治療作用[19]；同時EMT及其活化劑過度表達與CDDP抵抗性呈正相關(guān)。此外，血管內(nèi)皮生長因子C已參與到CDDP敏感性調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)[20]。本次研究采用Western blot檢測HMGN5基因敲除后5637細胞系，可見P-Akt、SLUG、E-Cad及VEGF-C蛋白水平受到顯著抑制，提示PI3k/Akt信號傳導(dǎo)、EMT及淋巴管生成參與到這一過程中。國外學(xué)者報道顯示，細胞凋亡激活是CDDP發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的主要機制[21]。本研究采用流式細胞術(shù)和Hoechst 33342染色，結(jié)果顯示，5637細胞系敲除HMGN5細胞凋亡水平顯著增強。

既往有報道顯示，CDDP可影響HMGN5基因表達及影響其下游信號分子[22]。針對這一現(xiàn)象，筆者認為HMGN5可能是CDDP治療相關(guān)分子靶點，故CDDP可直接抑制UBC細胞系中HMGN5表達；而另一種可能是CDDP可直接殺傷UBC細胞，從而導(dǎo)致HMGN5表達量減少。但這一機制仍不明確，尚需更深入研究證實。

綜上所述，HMGN5可能是順鉑治療的潛在靶點，抑制HMGN5基因有助于增加UBC細胞化療敏感性，這一作用主要通過干擾PI3K/Akt信號通路實現(xiàn)。