李世聰 朱華國 薛飛

摘 ? 要：本試驗利用SSR分子標記法，對玉米雜交種金慶707和世賓338玉米雜交種的種子純度進行了檢測。結(jié)果表明：8對SSR引物bnlg1940k7、 phi053k2、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg2305k4、bnlg1702k1、phi080k15和umc1492y13可用于金慶707種子純度鑒定;8對SSR引物umc2105k3、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg161k8、bnlg1702k1、umc1545y2、phi080k15和umc1432y6可用于品種世賓338種子純度鑒定。選用引物phi053k2檢測金慶707的種子純度為92%，選用引物bnlg1702k1檢測世賓338的種子純度為66%，兩者均未達到國家標準。本研究從玉米20對SSR核心引物中篩選出8對多態(tài)性引物可用于金慶707和世賓338兩個品種的種子純度檢測，大大縮短了種子純度檢測的周期。

關(guān)鍵詞：SSR分子標記;玉米雜交種;種子純度

玉米是我國一種很重要的糧食作物，也是飼料加工的重要來源，在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中處于很重要的位置[1]。種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最根本的生產(chǎn)資料，種子質(zhì)量的好壞決定了農(nóng)作物產(chǎn)量的多少和品質(zhì)的優(yōu)良，而種子純度的高低又是顯示種子質(zhì)量好壞的一項重要因素[2]。種子純度的檢測是發(fā)揮作物產(chǎn)量潛能和保證作物質(zhì)量的必要措施。根據(jù)前人的研究，種子純度下降1個百分點，將會直接導(dǎo)致作物產(chǎn)量減少大約1%[3]。種子市場的不規(guī)范，對育種者、種植戶以及經(jīng)銷商的利益造成極大的損害。新疆是中國的農(nóng)業(yè)大省，種子市場的“多亂混雜”，嚴重危害到育種者、種植戶以及經(jīng)銷商的利益，所以種子純度的鑒定十分必要。種子純度鑒定的方法主要包括田間形態(tài)鑒定和生化標記鑒定及DNA分子標記鑒定等[4]。

最初的田間形態(tài)鑒定，存在鑒定周期長、結(jié)果受環(huán)境影響較大、準確性差等缺點[5];生化標記鑒定是利用不同品種蛋白質(zhì)的不同得以鑒定，蛋白質(zhì)電泳鑒定容易遭受環(huán)境和生長狀況的影響。陳皆輝[6]、張承毅[7]等人利用生化標記鑒定的方法快速準確地將不同品種分開。相比之下，SSR標記具有多態(tài)性高、呈共顯性、操作簡便等優(yōu)點[8]。SSR分子標記法已廣泛應(yīng)用于各種農(nóng)作物的真實性以及純度鑒定，李苗[9]、

劉宏魁[10]、李陽[11]等人利用多態(tài)性SSR引物對玉米種子純度和指紋圖譜進行了分析。吳明生[12]等人利用SSR標記檢測了辣椒的種子純度。對玉米種子純度進行檢測，利于玉米種子市場的監(jiān)管、保障生產(chǎn)者和經(jīng)營者的利益。

本研究從玉米20對SSR引物中篩選出可用于金慶707和世賓338兩個玉米品種純度鑒定的特異性引物，并利用特異性引物對金慶707和世賓338抽樣種子進行純度鑒定。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 材料

試驗材料：金慶707雜交種及其父母本種子、世賓338及其父母本種子，20對SSR引物序列來自數(shù)據(jù)庫（https：//www.maizegdb.org/）。

試劑：氯仿、SDS提取液、異丙醇、5mol/L氯化鈉溶液、β-巰基乙醇、70%乙醇、TE緩沖液、ddH2O、10×Buffer、MgCl2、dNTP、Taq酶、引物、95%乙醇。

1.2 ? 試驗方法

1.2.1 ? SDS法提取玉米種子的DNA

參考郭景倫等[13]的方法，提取玉米DNA，每個品種隨機選取50粒種子提取種子胚中的DNA。

1.2.2 ? SSR引物篩選及純度鑒定

選取玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程NY/T 2475-2013中公布的20對玉米SSR引物，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。以金慶707和世賓338父母本基因組DNA為模板，經(jīng)過PCR擴增和8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，在20對SSR引物中篩選出能夠明顯區(qū)分父母本的多態(tài)性引物。

PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2μL，2.5mM dNTPs1.2μL，上下游引物10μM各0.25μL，5U/μLTaq DNA聚合酶0.2μL，模板DNA2μL，無菌水補全到20μL。SSR的擴增程序為：94℃預(yù)變性4min，94℃變性45s，引物退火溫度退火45s，72℃延伸45s，共35個循環(huán);72℃延伸10min，PCR產(chǎn)物保存于4℃。反應(yīng)程序的反應(yīng)時間、溫度、次數(shù)等可根據(jù)PCR儀器、酶以及引物等的不同作出相應(yīng)的調(diào)節(jié)。

擴增產(chǎn)物通過8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（150V60～80min）分離，銀染顯色，觀察記錄。

1.2.3 ? 數(shù)據(jù)記錄

檢測樣品與對照樣品（父本、母本）在同一電泳板上并排電泳時，將檢測樣品與對照樣品兩兩比較，并標記每個位點的異同情況。

2 ? 結(jié)果與分析

2.1 ? 用于金慶707和世賓338純度鑒定的多態(tài)性SSR引物篩選

20對SSR引物對金慶707和世賓338父母本DNA進行擴增，結(jié)果分別見圖1、圖2。在金慶707親本間擴增產(chǎn)物具有明顯差異的引物有bnlg1940k7、phi053k2、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg2305k4、bnlg1702k1、phi080k15、umc1492y13共8對SSR引物，在世賓338親本間擴增產(chǎn)物具有明顯差異的引物有umc2105k3、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg161k8、bnlg1702k1、umc1545y2、phi080k15、umc1432y6共8對SSR引物。

2.2 ? 金慶707種子純度鑒定

從篩選出的8對可用于金慶707種子純度鑒定的引物中選用引物phi053k2對金慶707及其父母本基因進行擴增，通過對電泳條帶的分析可以得出金慶707種子樣本的純度。結(jié)果如圖3所示，所抽種子檢測樣品樣本有3種類型：雜交種金慶707種子、父本自交系種子和母本自交系種子。根據(jù)公式計算，本批金慶707種子純度為92%，其中有4%的父本自交系雜種，4%的母本自交系雜種。

2.3 ? 世賓338種子純度鑒定

選用引物bnlg1702k1對世賓338及其父母本DNA進行擴增，對抽樣批次世賓338種子樣本的種子純度進行檢測，結(jié)果如圖4所示，所抽種子檢測樣品樣本有2種類型：雜交種種子和母本自交系種子。經(jīng)過計算，本批世賓338的種子純度為66%，含有34%的母本自交系雜種。

3 ? 討論

本研究從20對玉米SSR引物中篩選出多態(tài)性引物，對金慶707和世賓3382個品種的種子純度進行了檢驗。劉勤紅[14]、盧虹[15]、李汝玉等[16]采用了SSR分子標記的方法，分別在棉花、油菜和玉米等作物的種子純度上進行研究，并且得到的結(jié)果與傳統(tǒng)田間鑒定相符合。結(jié)合前人大量試驗和本試驗的結(jié)果表明，SSR分子標記法在玉米和其他作物的種子純度鑒定中都能夠取得良好的結(jié)果。

4 ? 結(jié)論

本試驗利用SSR分子標記法對2個玉米雜交種金慶707和世賓338進行了種子純度鑒定。金慶707玉米雜交種抽樣批次的種子純度為92%， 世賓338玉米雜交種抽樣批次的種子純度為66%，都未達到玉米單交種大田用種96.0%的種子質(zhì)量標準要求。

參考文獻：

[ 1 ] 羅黎明，劉麗，于麗娟，等.DNA分子標記技術(shù)在玉米種子純度鑒定中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)進展，2011，1（1）：7-13.

[ 2 ] 劉子記，曹振木，楊衍.應(yīng)用分子標記檢測作物雜交種純度研究現(xiàn)狀及比較分析[J].長江蔬菜，2013（12）：10-15.

[ 3 ] 趙欣欣，于運國，崔克艷.玉米種子純度室內(nèi)檢驗方法的研究現(xiàn)狀與應(yīng)用展望[J].種子科技，2010，28（1）：24-27.

[ 4 ] 張體付，葛敏，韋玉才，等.玉米功能性Insertion/Deletion（InDel）分子標記的挖掘及其在雜交種純度鑒定中的應(yīng)用[J].玉米科學(xué)，2012，20（2）：64-68.

[ 5 ] 孔菲.SSR分子標記在玉米種子純度鑒定中的應(yīng)用[J].種子世界，2011（2）：33-34.

[ 6 ] 李英孜，陳皆輝.玉米蛋白質(zhì)電泳法與田間種植鑒定法測定雜交種純度相關(guān)性試驗[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，1998（S1）：33-34.

[ 7 ] 張承毅，吳承來，張春慶.蛋白質(zhì)電泳法鑒定大白菜種子純度[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（3）：108-110.

[ 8 ] 孫加梅，王雪梅，王東建，等.谷子SSR標記研究進展[J].生物技術(shù)，2012，22（5）：86-89.

[ 9 ] 李苗，李新，甘曉燕，等.SSR標記對寧單11種子純度的鑒定[J].種子，2010，29（9）：38-39，43.

[ 10 ] 劉宏魁，閆洪朗，原亞萍.應(yīng)用鹽溶蛋白電泳和SSR分子標記鑒定玉米種子純度的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（19）：11396-11398.

[ 11 ] 李陽，范夢偉，季曉坤，等.利用SSR技術(shù)鑒定玉米雜交種“家佳榮2號”的種子純度[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2018，31（7）：1349-1354.

[ 12 ] 吳明生，趙海艷，黃鈴冰.利用SSR標記快速鑒定辣椒種子純度[J].種子世界，2017（11）：13-15.

[ 13 ] 郭景倫，趙久然，尉德銘，等.玉米單粒種子DNA提取新方法[J].北京農(nóng)業(yè)科學(xué)，1997（2）：2-3.

[ 14 ] 劉勤紅，王芙蓉，張軍，等.利用SSR標記鑒定魯棉研15號雜交種純度的研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003（2）：7-9.

[ 15 ] 盧虹，徐愛遐.SSR分子標記技術(shù)在甘藍型油菜雜交種陜油16純度鑒定中的應(yīng)用[J].種子，2016，35（6）：123-126.

[ 16 ] 李汝玉，李群，譚振馨，等.利用SSR標記鑒定玉米雜交種純度技術(shù)規(guī)程[J].種子，2005（9）：54-56.

（收稿日期：2019-03-31）