杜曉鵬 郭濤

摘 ? 要：在全面獲取轉(zhuǎn)基因玉米信息的基礎(chǔ)上打造玉米轉(zhuǎn)基因檢測分子特征矩陣，根據(jù)元件信息打造轉(zhuǎn)基因玉米篩查檢測策略，就轉(zhuǎn)基因玉米種子快速篩查方法的應(yīng)用成效問題進(jìn)行探究，經(jīng)過試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)DNA熱堿提取方法和復(fù)合PCR技術(shù)結(jié)合能夠提升轉(zhuǎn)基因玉米篩查成效，提升玉米的產(chǎn)量。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因玉米;快速篩查;方法應(yīng)用

轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究和發(fā)展為玉米的遺傳改良提供了廣闊的發(fā)展前景，篩查法是對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中通用元件進(jìn)行檢查的方法，具體原理是根據(jù)已知轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的外源插入元件分布情況，挑選出使用頻率最高的幾個(gè)外源元件作為檢測指標(biāo)[1]。如果檢測出任何一個(gè)元件，則證明樣品中包含轉(zhuǎn)基因的成本。為此，本文對轉(zhuǎn)基因玉米種子快速篩查方法的應(yīng)用問題進(jìn)行探究。

1 ? 轉(zhuǎn)基因玉米種子快速篩查材料和方法的選擇

1.1 ? 材料和生化試劑

由國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)督檢測測試中心提供BT176和BT11類型的玉米，所有的玉米樣品進(jìn)行粉碎處理，放置在4℃環(huán)境中保存。

從美國生物系統(tǒng)公司購買配套試劑盒進(jìn)行樣品的定量反應(yīng)分析，從北京某科技公司購買種子DNA提取試劑盒、Taq酶、DNA Marker，應(yīng)用3種不同顏色的熒光劑來標(biāo)記基因。

1.2 ? 方法

第一，DNA的提取和檢測。DNA提取采取快速提取方法，具體是稱取50mg的玉米粉末樣品，在樣品選擇之后將其放置在1.5mL的離心管中，在離心管中加入20μL的硝酸鈉溶液，震蕩30s之后將離心管放置在沸水中加熱5min。第二，試劑盒法檢測。按照試劑盒內(nèi)部的使用說明書來檢測轉(zhuǎn)基因玉米種子。第三，質(zhì)量檢測。采用1%比例的瓊脂糖凝膠對提取的DNA進(jìn)行電泳檢測。

2 ? 轉(zhuǎn)基因玉米種子快速篩查結(jié)果分析

2.1 ? 轉(zhuǎn)基因玉米種子DNA提取質(zhì)量分析

經(jīng)過試驗(yàn)比對分析之后發(fā)現(xiàn)，熱堿法提取的DNA和試劑盒提取的DNA相比，所能夠提出的轉(zhuǎn)基因玉米種子DNA數(shù)量較少，且DNA的彌散現(xiàn)象比較嚴(yán)重，而出現(xiàn)這種問題的原因是DNA在熱堿的作用下存在不同程度的降解現(xiàn)象[2]。

2.2 ? 打造復(fù)合熒光PCR體系

在轉(zhuǎn)基因玉米種子檢測的過程中，為了能夠降低不同引物之間的競爭以及熒光背景對檢測的干擾，可以將3個(gè)被檢測基因的引物和探針濃度設(shè)置為3個(gè)不同梯度的組合，在對組合優(yōu)化分析之后最終確立3個(gè)被檢基因引物及其探針的合適濃度。CaMV353啟動(dòng)子的引物和探針濃度為200nmol/L，MOS終止子和BAR基因引物最后的濃度為250nmol/L，探針的最終濃度為300nmol/L。

2.3 ? 六重PCR檢測優(yōu)化

在按照規(guī)范方案配比操作的時(shí)候，各個(gè)基因的擴(kuò)增效率基本保持在一致的狀態(tài)，但是其他引物濃度梯度結(jié)果不理想。在考慮這些因素之后，最終發(fā)現(xiàn)非特異性條帶的出現(xiàn)不會(huì)影響引物濃度梯度試驗(yàn)對目的條帶的判斷，為此在更進(jìn)一步試驗(yàn)操作的時(shí)候，需要采取措施對非特異性條帶內(nèi)容進(jìn)行優(yōu)化處理。同時(shí)，從退火溫度梯度檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，退火溫度太低會(huì)出現(xiàn)特異性的條帶，但是如果退火溫度較高則是會(huì)讓不需要的條帶進(jìn)行理想擴(kuò)增，由此出現(xiàn)非特異性條帶。確定六重PCR反應(yīng)體系各個(gè)玉米基因引物濃度配合比和退火溫度之后，發(fā)現(xiàn)檢測樣品的擴(kuò)增條帶與其分子特征顯示的基因元件基本保持在一致的狀態(tài)。在已知樣品中不含有PMI目的基因的時(shí)候，擴(kuò)增的目的基因條帶大小一般在262bp以下，非特異性條帶的大小則是在380bp以上。

綜上所述，玉米是擁有轉(zhuǎn)化體數(shù)量最多的一種作物，多種形式的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體有效豐富了玉米的應(yīng)用，但是在無形中也增加了對玉米轉(zhuǎn)基因成分的檢測篩查難度。在國內(nèi)，由于沒有批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因玉米的商業(yè)化種植，當(dāng)前玉米的轉(zhuǎn)基因成本檢測主要是針對違規(guī)轉(zhuǎn)基因一系列事件中的樣品檢測。在玉米轉(zhuǎn)基因成分的檢測篩查工作中，為了能夠提升轉(zhuǎn)基因的檢測效率，需要相關(guān)人員借助先進(jìn)的科技來優(yōu)化試驗(yàn)方法，在玉米轉(zhuǎn)基因檢測過程中特別是要加強(qiáng)對DNA檢測的關(guān)注。文章在熱堿法快速提取玉米種子胚DNA檢測的基礎(chǔ)上，提出了玉米種子粉末DNA快速檢測方法，有效提升了熒光PCR的靈敏度和擴(kuò)增特異性能。另外，針對大批量樣品檢測操作煩瑣的問題，還需要相關(guān)人員應(yīng)用系統(tǒng)來分析轉(zhuǎn)化體的分子特點(diǎn)，對于篩查后表征為陽性的樣品再次進(jìn)行2次篩查，從而進(jìn)一步提升轉(zhuǎn)基因玉米種子快速篩查效率，并為我國農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因安全監(jiān)督管理提供重要的技術(shù)參考，確保玉米的食用安全、培育安全和生產(chǎn)環(huán)境安全。

參考文獻(xiàn)：

[ 1 ] 吳明生，云曉敏，宋歌，等.轉(zhuǎn)基因玉米種子快速篩查方法研究與應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報(bào)，2013（1）：102-106.

[ 2 ] 張海波，張英，劉冰，等.玉米中轉(zhuǎn)基因成分篩查策略[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，24（12）：57-63.

（收稿日期：2019-07-12）