李 靜, 王 莉, 道 敏, 胡 平, 肖 逸, 韓建林, 王玉濤*

1.喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院, 新疆維吾爾自治區(qū)葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究高校重點實驗室, 新疆 喀什 844000;2.新疆維吾爾自治區(qū)塔什庫爾干縣畜牧獸醫(yī)局, 新疆 塔什庫爾干縣 845250

牦牛(Bosgrunniens)，屬哺乳綱(Mammalia)，偶蹄目(Artiodactyla)，反芻亞目(Ruminantia)，?？?Bovidae)[1]，主要分布在中國青藏高原以及與其相鄰近的亞高原地區(qū)[2～4]，中國牦牛是世界牦牛數(shù)量最多[5～7]、品種資源最豐富的國家[8,9]，中國牛品種志收錄的地方牦牛品種有5個[10]，現(xiàn)國家鑒定的牦牛品種(類群)18個，西藏藏族自治區(qū)主要的牦牛品種為帕里牦牛、嘉黎牦牛和斯布牦牛，青海省主要分布環(huán)湖牦牛和高原牦牛，四川省主要牦牛品種為九龍牦牛和麥洼牦牛，甘肅省主要牦牛品種為天祝牦牛和甘南牦牛，云南省牦牛品種為中甸牦牛，新疆維吾爾自治區(qū)已鑒定的牦牛品種為巴州牦牛，2014年后又陸續(xù)鑒定出四川省木里牦牛、金川牦牛、西藏藏族自治區(qū)類烏齊牦牛、青海省雪多牦牛、四川省昌臺牦牛；培育品種兩個：包括青海省大通牦牛[11]和阿什旦牦牛[12～14]，而以上品種資源均未涵蓋分布于新疆喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)的牦牛群體，是地方牦牛品種資源認(rèn)定分布上未涉及的種群。

牦牛幾乎是集各種家畜產(chǎn)品優(yōu)勢[15]、性能于一身的多功能動物[16～18]，是我國高寒地區(qū)的主要畜種和重要的生產(chǎn)資料[9,19,21]。對牦牛遺傳多樣性的研究有助于了解牦牛的分類地位及其品種的遺傳多樣性，本文對牦牛地方種群現(xiàn)狀進行了分子遺傳學(xué)分析，對牦牛資源的合理保護與科學(xué)利用具有重要意義。

在研究動物遺傳多樣性分子標(biāo)記中，哺乳動物線粒體細(xì)胞色素b(Cytb)基因是線粒體DNA中重要的蛋白編碼基因，它包含從種內(nèi)到種間乃至到科間的進化遺傳信息[21]，因而被廣泛地用來進行脊椎動物種上和種下系統(tǒng)進化研究[22]，被認(rèn)為是解決系統(tǒng)發(fā)育問題最可信的線粒體DNA標(biāo)記之一。常國斌[23]對20頭巴州牦牛進行研究分析發(fā)現(xiàn)，巴州牦牛核苷酸多樣性相對貧乏，單倍型多樣性相對較豐富，推測巴州牦?？赡艽嬖诓煌哪赶灯鹪础Ｍ跆m萍等[24]在分析巴州牦牛時發(fā)現(xiàn)，一部分巴州牦牛含野牦牛血統(tǒng)，推測可能由于這部分牦牛與野牦牛有共同祖先，在漫長進化過程中仍保留相似序列。涂世英等[25]研究中甸牦牛發(fā)現(xiàn)，中甸牦牛核苷酸多樣性較貧乏，而單倍型多樣性較豐富，推測中甸牦?？赡艽嬖诓煌哪赶灯鹪?，系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明中甸牦牛與野牦牛親緣關(guān)系較近，其次是美洲野牛，推測中甸牦牛在發(fā)展的過程中與野牦牛發(fā)生了基因交流，作者支持牦牛屬于牛亞科牦牛屬的觀點。胡丹[26]對新疆塔什庫爾干縣牦牛10個個體的mtDNA D-loop序列和mtDNACytb進行分析，表明塔什庫爾干縣牦牛具有豐富的遺傳多樣性，支持牦牛和野牦牛劃分為牛亞科牦牛屬的觀點，但該研究采集樣本少且地理覆蓋率低。以上研究均未對分布在喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)的牦牛群體進行深入研究，因此該地區(qū)牦牛遺傳多樣性、遺傳分化及系統(tǒng)地位尚不清楚。

牦牛在牛亞科中的分類地位一直是牛亞科動物遺傳發(fā)育領(lǐng)域的熱點問題，牦牛是隸屬于牛亞科中獨立的牦牛屬，還是與北美野牛隸屬于野牛屬，或是作為牛亞科牛屬牦牛亞屬仍存在熱議，到目前為止仍沒有確定的結(jié)論。姬秋梅[27]、李齊發(fā)[28]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，牦牛與野牦牛、美洲野牛親緣關(guān)系較近，與牛屬關(guān)系較遠(yuǎn)，李齊發(fā)[28]推測家牦牛與野牦牛的分化時間約為55萬年前。楊萬遠(yuǎn)[29]對野牦牛分析發(fā)現(xiàn)，野牦牛具有豐富的遺傳多樣性，支持將牦牛劃分為牛亞科中一個獨立的牦牛屬，李齊發(fā)[28]也認(rèn)為家牦牛和野牦牛應(yīng)劃分為牛亞科獨立的牦牛屬。但常國斌[23]、錢建新[30]基于水牛屬的系統(tǒng)發(fā)育地位，認(rèn)為牦牛應(yīng)歸為牛屬中牦牛亞屬更合理。耿榮慶[31]牛亞科動物親緣關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，大額牛與瘤牛之間可能有共同的母系起源；家牛與準(zhǔn)野牛屬親緣關(guān)系相近、其次是牦牛屬，認(rèn)為牛亞科動物應(yīng)劃分為4個屬，包括家牛屬、準(zhǔn)野牛屬、牦牛屬和亞洲水牛屬。

喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)海拔高、常年積雪、氣候干旱、地勢險峻，這里形成了天然的地理隔離帶[32,33]，從而造成牦牛之間基因交流少，群體退化較為嚴(yán)重，物種資源保護與利用亟待解決。為進一步明確喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛遺傳多樣性水平、遺傳分化和系統(tǒng)進化地位，本文以分布在該區(qū)域的牦牛為研究對象，選擇mtDNACytb遺傳標(biāo)記，利用PCR直接測序和生物信息學(xué)方法，研究喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛mtDNACytb序列特征和遺傳多樣性水平，選擇GenBank中已提交的野牦牛及不同品種家牦牛序列，利用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，這將為該區(qū)域牦牛遺傳資源保護和利用提供理論依據(jù)；利用牛亞科代表物種序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，研究牦牛在牛亞科中的分類地位。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗采集覆蓋疆喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)5個地方(塔什庫爾干縣、烏恰縣、阿克陶縣、阿合奇縣、葉城縣)牦牛群體血樣或肌肉組織樣本共計110個(表1)。血液樣本采取頸靜脈采血，ACD抗凝劑抗凝，-80℃超低溫保存；肌肉組織樣品取屠宰廠牦牛背最長肌，編號后冷凍保存，運輸途中保持低溫，儲存于喀什大學(xué)葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究高校重點實驗室-80℃冰箱，取部分樣品在100%乙醇中固定，分樣保存。

1.2 基因組DNA提取

血液和肌肉組織DNA提取方法參考經(jīng)典的苯酚-氯仿抽提法，在此基礎(chǔ)上，由于血液、肌肉組織中蛋白質(zhì)含量較多，本實驗中對飽和酚、氯仿-異戊醇處理步驟適當(dāng)重復(fù)及處理時間適當(dāng)增加。

表1 牦牛樣本采集的樣品信息Table 1 Sample information collected in this study.

1.3 引物設(shè)計和PCR擴增

引物設(shè)計與合成：以GenBank數(shù)據(jù)庫中已提交的家牦牛的mtDNA序列(GenBank登陸號：GQ464270.1、JQ692071.1)為參考序列，利用Primer Premier 5.0軟件進行引物設(shè)計，引物序列為：YAK mtDNAcytb-F：5′-GTTCCGTAGCCATAGCCG-3′, YAK mtDNAcytb-R: 5′-TTGAGTCTTAGGGAGGTT-3′。PCR目的產(chǎn)物的大小約為1 520 bp，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系：總體積50 μL，其中2×TaqPCR Mix 26 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各1 μL，DNA模板(100 ng/μL) 2 μL，ddH2O 20 μL。擴增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，51.5℃退火30 s，72℃延伸80 s，40個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增產(chǎn)物送蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

1.4 序列分析

通過Chromasversion 2.6.6原始序列峰圖數(shù)據(jù)進行人工校對。利用Clustal X軟件對所測定的mtDNACytb序列進行同源序列比對，用MEGA 5.2、MEGA 6.06統(tǒng)計序列堿基組成分析，用DNASP 5.10.01軟件進行單倍型的推導(dǎo)，并開展遺傳多樣性的分析；最后將獲得的單倍型數(shù)據(jù)用MEGA 6.06軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用軟件NETWORK 4.1.0.9進行單倍型的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和頻率分布分析。從GenBank數(shù)據(jù)庫下載已提交的野牦牛及中國不同品種牦牛mtDNACytb的同源序列共82條，這些序列的來源信息見表2，同時下載42條牛亞科代表物種及綿羊、犀牛序列，序列的來源信息見表3，將GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的序列進行比對剪切為1 400 bp，便于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增

對110個喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛mtDNACytb區(qū)進行擴增，用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測(圖1)。擴增產(chǎn)物條帶質(zhì)量較好，條帶清晰、明亮、單一，無非特異性擴增產(chǎn)物，符合后續(xù)的PCR產(chǎn)物測序要求。

2.2 牦牛mtDNA Cytb序列分析

2.2.1牦牛mtDNACytb核苷酸組成 測序結(jié)果與參照序列GQ464270.1進行比對、人工矯正后，將測序獲得的1 150 bp序列與參照序列GQ464270.1、JQ692071.1進行對比和校對后，最后獲得長約1 140 bp的核苷酸序列用于進一步分析。

表2 從GenBank 下載的牦牛mtDNA Cytb 序列信息Table 2 Information of mtDNA Cytb sequences in yak retrieved from GenBank.

表3 從GenBank 下載的牛亞科代表物種mtDNA Cytb 序列信息Table 3 Information of mtDNA Cytb sequences of bovine subfamily representative species from GenBank.

圖1 mtDNA Cytb全長擴增結(jié)果Fig.1 Results of full length amplification of mitochondrial mtDNA Cytb.

利用Clustal X 軟件對所測定的mtDNACytb序列進行同源序列比對后，通過MEGA5.2對mtDNACytb全序列長度和堿基組成進行分析(表4)。由表中可以看出這6個牦牛群體mtDNACytb中T、C、A和G 4種堿基的平均比例分別為26.2%(26.1%～26.2%)、29.0%(28.0%～29.1%)、31.7%和13.1%，在不同種群之間，mtDNACytb序列堿基差異不明顯。

表4 5個牦牛群體mtDNA Cytb序列(1 140 bp)的堿基組成Table 4 Nucleotide composition in the mtDNA Cytb sequences (1 140bp) of five populations of yak

2.2.2喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛mtDNACytb多態(tài)位點分析 用DNASP 5.10.01軟件對喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)5個牦牛種群的110個樣品的mtDNACytb全序列分析共檢測出多態(tài)位點10個，界定出單倍型5個(表5，圖2)。其中H1、H4為特有單倍型，單倍型H1為阿合奇縣牦牛特有單倍型包含4個個體；單倍型H4為烏恰縣牦牛特有單倍型僅有2個個體；單倍型H2、單倍型H5為優(yōu)勢單倍型，5個牦牛群體均包含單倍型H2，共35個個體，單倍型頻率為31.82%；5個牦牛群體也均含有單倍型H5，共65個個體，單倍型頻率為59.09%；單倍型H3為3個牦牛群體共享單倍型，共有6個個體含1個阿克陶縣牦牛、1個烏恰縣牦牛、4個塔什庫爾干縣牦牛。

表5 5個牦牛群體中5個線粒體mtDNA Cytb單倍型(1 140 bp )在各群體中的分布Table 5 Distribution of five mitochondrial mtDNA Cytb haplotypes (1 140 bp) in five yak populations.

圖2 5個牦牛群體5個線粒體mtDNA Cytb單倍型(1 140 bp )中10個多態(tài)位點的分布Fig.2 Distribution of 10 polymorphic loci in 5 mitochondrial mtDNA Cytb haplotypes (1 140 bp) in 5 yak populations.

2.2.3喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)mtDNACytb核苷酸多樣性和單倍型多樣性分析 用DNASP5.10.01軟件對喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛5個牦牛群體的110個個體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性進行系統(tǒng)分析(表6)，發(fā)現(xiàn)總的平均單倍型多樣性(Hd)為0.566±0.001 23，平均核苷酸多樣性(π)為0.002 95，平均核苷酸差異性(K)為3.363。

2.2.4基于mtDNACytb序列分析牦牛在牛亞科中的分類地位 為了揭示喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛群體與中國地方牦牛品種的差異情況和遺傳

表6 5個牦牛群體mtDNA Cytb 序列遺傳多樣性相關(guān)參數(shù)的分析結(jié)果Table 6 Results of genetic diversity parameters of mtDNA Cytb in the five populations of yak.

關(guān)系，為喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛的品種鑒定提供理論基礎(chǔ)，我們進一步對提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中的不同地區(qū)牦牛品種的mtDNACytb序列進行比對分析和聚類分析(圖3，表7，圖4)。

通過DNASP 5.10.01軟件對喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛與野牦牛及中國10個牦牛品種和西藏地區(qū)牦牛mtDNACytb(1140 bp)共82條序列檢測出35個多態(tài)位點，共獲得24個單倍型(表7，圖4)。單倍型H2、H3、H4、H5為優(yōu)勢單倍型，其中單倍型H2含有97個個體，占個體總數(shù)的50%；每個家牦牛品種中均含有1個特有單倍型，野牦牛含有7個特有單倍型；基于各種群間的遺傳距離構(gòu)建系統(tǒng)進化樹顯示喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛與野牦牛親緣關(guān)系較近，與巴州牦牛親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)。

2.2.5基于mtDNACytb序列分析牦牛在牛亞科中的分類地位 為了明確牦牛在牛亞科中的分類地位，我們進一步對提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中的牦牛mtDNACytb序列進行了比對，建樹分析牦牛的分類地位，將110個喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛和下載的82條牦牛序列進行單倍型分析后，將牦牛形成的24個單倍型與牛亞科代表物種42個序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)，結(jié)果表明：牦牛首先和美洲野牛聚類，形成的分支與歐洲野牛聚類，再與印度野牛、大額牛、林牛、爪哇野牛及普通牛與原牛、瘤牛形成的分支聚為一類，最后和水牛屬相聚。

3 討論

本研究測定mtDNACytb基因全長為1 140 bp，牦牛mtDNACytb基因不存在長度變異；T、C、A和G堿基的平均含量分別為26.2%、29.0%、31.7%、13.1%，其中A+T堿基含量(57.9%)大于C+G堿基的含量(42.1%)，表現(xiàn)出了堿基的偏倚性；共發(fā)現(xiàn)10個多態(tài)位點：均為轉(zhuǎn)換，與胡丹[26]研究10頭塔什庫爾干縣牦牛分析共得到3個SNP 位點變異類型結(jié)果一致，而與涂世英[25]分析中甸牦牛mtDNACytb基因發(fā)現(xiàn)3個多態(tài)位點及楊萬遠(yuǎn)[29]對 6頭野牦牛 mtDNACytb基因研究發(fā)現(xiàn) 13 處變異位點的變異類型(轉(zhuǎn)換、顛換)存在差異；表明喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛mtDNACytb基因SNP 位點較豐富，不同牦牛品種的SNP位點變異類型存在差異。

表7 12個牦牛群體24個mtDNA Cytb 單倍型(1 140 bp )在各群體中的分布Table 7 Distribution of 24 mtDNA Cytb haplotypes (1 140 bp) from 12 yak populations in each population.

圖4 12個牦牛群體24個線粒體mtDNA Cytb單倍型(1 140 bp )中35個多態(tài)位點的分布Fig.4 Distribution of 35 polymorphic loci in 24 mitochondrial mtDNA Cytb haplotypes (1 140 bp) from 12 yak populations.

圖5 牛亞科代表物種間mtDNA Cytb序列系統(tǒng)進化發(fā)育聚類圖Fig.5 Clustering gram of development and evolution between species of bovine subfamily based on mtDNA Cytb sequence.

本研究喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)110個牦牛中共界定出5個單倍型，平均單倍型多樣性(Hd)為0.566±0.001 23，平均核苷酸多樣性(π)為0.002 95，平均核苷酸差異性(K)為3.363。與涂世英[25]研究的中甸牦牛、常洪等[24]分析的巴州牦牛、胡丹[26]塔什庫爾干縣牦牛mtDNACytb的研究結(jié)果相比，平均單倍型多樣性(Hd)、平均核苷酸多樣性(π)均較高；但與姬秋梅[27]研究測定的西藏牦牛mtDNACytb基因相比平均單倍型多樣性(Hd)、平均核苷酸多樣性(π)均較低。說明西藏牦牛遺傳多樣性最為豐富，喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛遺傳多樣性較為豐富，而中甸牦牛、巴州牦牛遺傳多樣性較弱；西藏牦牛豐富的遺傳多樣性與西藏是牦牛起源的觀點相符；喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛遺傳多樣性較為豐富，但基于喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)為天然的地理隔離帶，推測可能是由于最初遷徙至喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)的牦牛含不同起源有關(guān)。

本研究中牦牛與美洲野牛親緣關(guān)系較近，與普通牛、原牛及瘤牛親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。前期基于mtDNA D-loop區(qū)序列研究，郭松長[34]認(rèn)為牦牛應(yīng)與草原野牛、美洲野牛合為一個屬，而不是獨立為牦牛屬；李齊發(fā)[1]、鐘金城[35]支持將牦牛、野牦牛劃分為牛亞科中牦牛屬的觀點；基于野牦牛線粒體全基因組研究，鐘金城[36]認(rèn)為牦牛屬應(yīng)為牛亞科中的一個獨立屬；基于mtDNACytb區(qū)序列研究，李齊發(fā)[26]也認(rèn)為家牦牛和野牦牛應(yīng)劃分為牛亞科獨立的牦牛屬；常國斌[23]、錢建新[30]基于水牛屬的系統(tǒng)發(fā)育地位，認(rèn)為牦牛應(yīng)歸為牛屬中牦牛亞屬更合理。本研究認(rèn)為牦牛應(yīng)屬于牛亞科中獨立的牦牛亞屬。

本研究首次以喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛為研究對象，對喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛110個個體的mtDNACytb基因進行了測序，序列長均為1 140 bp，形成5種單倍型，含10個多態(tài)位點，核苷酸變異類型僅為轉(zhuǎn)換，平均單倍型多樣性(Hd)、平均核苷酸多樣性(π)較高，其群體變異程度高，遺傳多樣性較為豐富，系統(tǒng)進化樹表明與野牦牛親緣關(guān)系較近，與其他地方品種牦牛親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛遺傳背景獨特，具有作為我國優(yōu)良地方牦牛品種的遺傳資源的潛質(zhì)，應(yīng)加大對喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛品種優(yōu)良資源的保護。