張在寶, 趙 海, 胡夢輝, 鄧麗君, 王 琦, 李九麗, 袁紅雨,2

1.信陽師范學院生命科學學院, 河南 信陽 464000;2.信陽師范學院, 河南省茶學重點實驗室, 河南 信陽 464000

長期以來，由于核酸分子和與之相關的測序技術的特點，基因組學和轉錄組學是最早成功應用于大規(guī)模研究基因功能的組學技術。尤其是轉錄組學，因細胞或組織中mRNA的水平直接與相關基因的表達有關，其在基因功能的研究中得到了非常廣泛的重視。然而， mRNA的表達水平并不能很好地反映蛋白質的表達情況。目前學術界比較認同的觀點是某物種推定合成的蛋白質組分別都超過了其基因組和轉錄組(mRNA)的數量，這主要是由mRNA的選擇性剪接和復雜多樣的各種翻譯后修飾所致[1]。因此，蛋白質組學在植物的花藥發(fā)育研究中的應用必定會極大地補充轉錄組學的研究。作為各種生理功能的直接參與者，對花藥蛋白質功能的大規(guī)模研究將更加深入地幫助人們揭示并理解關鍵蛋白質的功能和各種復雜的與發(fā)育或代謝相關的網絡調控機制。目前，蛋白質組學已經在花藥發(fā)育關鍵蛋白的研究、抗逆蛋白的篩選和蛋白的翻譯后修飾機制及功能等方面獲得了廣泛應用。

與蛋白質組學相比，代謝組學出現的時間要更晚一些。但是隨著相關技術的發(fā)展，與代謝組學相關的文獻日益增多，這說明人們越來越重視在生物化學層面大規(guī)模地探究各種生物小分子所發(fā)揮的關鍵作用?；ㄋ幇l(fā)育是一個非常精細復雜的過程，涉及環(huán)境、遺傳和生化等多個層面的內容。各種組學技術(包括轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學)將對系統(tǒng)而深入地理解花藥發(fā)育的調控機制、逆境脅迫下的信號轉導以及系統(tǒng)發(fā)育的生化規(guī)律貢獻更多具有突破性的知識。

鑒于當前蛋白質組學和代謝組學在花藥發(fā)育方面的應用不斷深化，相關富有價值的研究成果不斷涌現，本系列文章前文已介紹了轉錄組學[2]在植物花藥發(fā)育研究中的應用，本文著重綜述蛋白質組學和代謝組學在植物花藥和花粉發(fā)育、雄性不育和逆境脅迫中的研究成果，以及磷酸化蛋白和乙酰化蛋白在花藥中的研究進展，并總結和評述了多層組學整合分析的發(fā)展趨勢。

1 蛋白質組學在花藥發(fā)育研究中的應用

蛋白質是生物體內關鍵的生物分子，對生命活動有著十分重要的作用。與基因不同，蛋白質在生長發(fā)育、代謝、繁殖和免疫防御等各個方面都有它獨特的作用[3]。蛋白質組的概念最先由Marc Wilkins在1994年提出，指由一個基因組，或一個細胞、組織表達的所有蛋白質。蛋白質組學是系統(tǒng)分析存在于組織、細胞或亞細胞區(qū)室的蛋白質組[4]?；ㄋ幇l(fā)育是一個復雜的過程，依賴于蛋白質合成和降解的調節(jié)[5]。擬南芥、水稻、玉米、煙草和番茄等植物基因組序列測序的完成為花藥的蛋白質組學研究奠定了基礎，蛋白質組學技術被廣泛地應用于花藥發(fā)育和花粉產生的研究中[4]?；ㄋ幍鞍踪|組學是植物蛋白質組學的一個重要組成部分。此外，出現了許多細胞特異性和亞細胞花藥蛋白質組學研究，有助于理解特定蛋白質在特定類型的細胞和亞細胞器中的作用和功能。蛋白質組學工具的優(yōu)點之一是可以研究由選擇性剪接、mRNA編輯、翻譯同步修飾和翻譯后修飾所產生的各種蛋白質[6]，因此被廣泛利用在各個領域。經過多年的發(fā)展和改進，目前常用的蛋白質組分析方法有二維凝膠電泳、質譜鑒定技術、蛋白質芯片技術、雙分子熒光互補技術等，利用這些技術可以對各種組織和細胞中的基因產物進行全面的分析，同時也可以對某些特定的蛋白質進行鑒定和定量以及結構和功能的分析[4]。表1中總結了蛋白質組學技術在不同植物花藥發(fā)育研究中的應用進展。

1.1 在研究花粉發(fā)育功能蛋白方面的應用

Kerim等[11]使用蛋白質組學研究在正常生長水稻花藥中花粉發(fā)育過程中蛋白質合成的變化模式，鑒定出的蛋白質在糖代謝、細胞伸長和細胞擴增等方面具有重要作用。另外，一些低豐度蛋白質可能在花粉發(fā)育過程中發(fā)揮著非常重要的調節(jié)作用。再者，一些相同蛋白質存在多種亞型，在花粉發(fā)育過程中，這些蛋白質會發(fā)生某種翻譯后修飾。這為水稻花藥蛋白質的補充及其在花粉發(fā)育過程中的時空調控提供了有用的信息?；ㄋ幇l(fā)育是一個高能耗過程，花藥或花粉發(fā)育過程中涉及的主要事件是細胞減數分裂、有絲分裂和花粉壁形成，以及花粉萌發(fā)的能量儲存，這為花粉將雄性配子傳遞到胚囊進行雙重受精奠定了基礎[23]。蛋白質組學分析表明，與糖類和能量代謝相關的蛋白質可能在花粉發(fā)育中發(fā)揮作用[24]。在Columbia 和Landsberg兩種生態(tài)型的擬南芥以及番茄花粉中鑒定出大量參與能量轉換相關的蛋白質[4,25,26]。除此之外，在這些物種的花粉中鑒定出的蛋白質功能多樣，涉及信號轉導、應激耐受、細胞骨架形成、轉錄、代謝、防御、細胞結構、蛋白質合成和加工、鈣離子結合等多個方面，這些存在于花粉中的蛋白質反映了這種小的雙細胞獨立結構的存活方式以及可能對隨后花粉萌發(fā)和花粉管生長產生的影響。花粉外壁是花粉粒的最外層，花粉外壁蛋白是花粉粘附和水合、花粉與柱頭識別和交流，以及花粉萌發(fā)和柱頭入侵所必需的?；ǚ弁獗诘鞍踪|組在親緣關系相近的物種中成分幾乎一致，在不同的物種中存在很大差異，這些差異可能反映在功能上；其次，一些花粉外壁蛋白顯示出相當多的形式，它們可能具有不同的生化功能或有助于花粉和柱頭的特異性識別。此外，許多這些蛋白質成分能夠在人體中引起IgE介導的免疫應答[27]。Kim等[12]使用鳥槍法對水稻花藥進行定量蛋白質組學分析，鑒定了3 266個非冗余蛋白質，ATP合成酶、含有Cupin結構域的蛋白質和花粉過敏原大量存在于水稻花藥中，這表明水稻花粉過敏原具有潛在的重要生理作用。

表1 蛋白組學在花藥發(fā)育研究中的應用Table 1 Application of proteomics in anther development research.

1.2 在解析雄性不育分子機制方面的應用

蛋白質組學經過不斷的發(fā)展已經被廣泛用于揭示多種植物中不育花藥蛋白質表達水平的變化，通過分析所得數據可以很好的解釋植物不育機制[28]。近年來，對水稻、番茄、油菜、枸杞、玉米和柚子等各種雄性不育突變體中進行了蛋白質組學分析，在這些物種中分離純化出了大量與雄性不育的產生有關的蛋白質，包括蛋白酶體亞基、ATP合成酶亞基、核糖核蛋白和類黃酮，這些極大地促進了雄性不育的研究[19]。Xing等[20]在白菜中發(fā)現與花粉發(fā)育、生長素和脅迫有關的基因響應和ATP合成基因的延遲表達導致花粉產生缺陷，從而導致雄性不育。Liu等[19]在棉花光敏雄性不育突變體中發(fā)現絨氈層的異常降解導致花粉外壁形成缺陷，活性蛋白酶體促進功能蛋白降解，Ca2+穩(wěn)態(tài)被擾亂，阻止植物花粉成熟，最終導致雄性不育。

植物雄性不育與線粒體功能障礙也有一定的關系，Wang等[23]在小麥中發(fā)現了71種引起花粉敗育的差異表達的線粒體基因，提出并證實了小麥中線粒體介導的雄性不育網絡。在化學雜交劑(CHA)-SQ-1誘導的生理雄性不育小麥中發(fā)現了103個差異表達的基因，這些基因與糖代謝、氧化應激和抗性、蛋白質代謝、光合作用、細胞死亡、細胞骨架和細胞結構有關[8]。通過同位素親和標簽(isotope-code affinity tag, ICAT)技術，在單核期水稻花藥中鑒定了97種非冗余蛋白，8種不同的細胞質雄性不育相關表達蛋白。將ICAT數據與RT-PCR數據結合分析，發(fā)現能量代謝可以控制紅蓮水稻細胞質雄性不育，同時這些數據幫助研究者們了解導致紅蓮水稻花粉敗育的分子機制和生化途徑[13]。

1.3 在篩選花藥抗逆蛋白方面的應用

水稻開花階段是對溫度最敏感的時期[16]。由于水稻適合在熱帶和亞熱帶地區(qū)生長，因此水稻具有易受低溫影響的特征，低溫易對早期小孢子發(fā)育造成損傷從而導致不育花粉的產生。在低溫處理的水稻植株的花藥中，花藥呼吸減少，蔗糖在花藥中積累，蛋白質水平下降，氨基酸組成也發(fā)生變化，體現在脯氨酸的大幅減少和天冬酰胺的增加[14]。Imin等[14]在水稻花藥中鑒定出了可能參與蛋白質合成和折疊、應激反應、脂質產生、細胞壁形成、蛋白質分解和能量代謝的冷敏感蛋白，并且會影響到生物過程；同時，他們已經觀察到冷處理會影響線粒體及其內膜、內質網、核糖體和細胞壁以及細胞外壁的形成。在低溫處理水稻花藥發(fā)育后期鑒定的蛋白質中觀察到7種蛋白質作為分解或裂解產物，證明了低溫脅迫在小孢子發(fā)育早期增強并誘導了三核花粉中的蛋白質的部分降解[15]?；ㄋ庨_裂易受到高溫影響，另外花粉萌發(fā)和花粉管生長對高溫也比較敏感。Jagadish等[16]在N22高耐熱型水稻中發(fā)現冷休克蛋白和熱休克蛋白顯著上調，熱休克蛋白作為變性蛋白質的中間體儲存，可以防止由于高溫引起的蛋白質聚集，熱休克蛋白的積累可能在保護細胞的代謝活動中發(fā)揮重要作用，這可能導致N22的耐熱性更強，而在高溫敏感型水稻中冷休克蛋白和熱休克蛋白表達水平卻明顯降低。

干旱脅迫對花藥發(fā)育的影響較為嚴重，特別是出現不可逆轉的傷害。在玉米中，干旱脅迫會導致開花和吐絲不同步，并抑制花藥開裂。Liu 和Bennett[6]對Moroberekan和IR64兩種基因型的水稻進行蛋白質組研究，發(fā)現應激誘導的不育不僅由糖代謝紊亂造成，也由花藥花粉發(fā)育和細胞功能紊亂造成。Sarhadi通過比較了鹽脅迫下鹽敏感型和耐鹽型兩種不同水稻基因型的蛋白質組，發(fā)現糖類代謝和能量代謝、花藥代謝和花粉壁重塑代謝可能參與水稻在生殖階段的鹽脅迫響應[17]。

1.4 在研究花藥蛋白磷酸化修飾方面的應用

蛋白質磷酸化指由蛋白質激酶催化的把ATP或GTP的γ位磷酸基轉移到底物蛋白質的氨基酸殘基上的過程。真核生物中，約有三分之一的蛋白質具有磷酸化修飾，體現了磷酸化修飾的普遍性和重要性。生物體內能被磷酸化修飾的所有蛋白質構成了這一生物的磷酸化蛋白質組。采用蛋白質組學的分析方法，研究細胞中所有磷酸化蛋白質及其修飾過程，從整體上觀察細胞中被修飾的磷酸化蛋白質的狀態(tài)及其變化，進而分析特定磷酸化修飾對生命過程的調控作用及其分子機制，構成了研究磷酸化蛋白質的全新內容，由此派生出磷酸化蛋白質組學這一新領域。隨著蛋白質組學研究技術的不斷發(fā)展，形成了一系列對磷酸化蛋白質進行富集分離、定性定量和功能分析的新方法，目前對磷酸化蛋白質的分離富集技術主要有32P放射性標記法、特異抗體的免疫共沉淀法、熒光染料染色和色譜分離法等技術。磷酸化蛋白質組學技術可以在單個項目中識別超過2萬個磷酸化位點。在真核生物中，絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸是最常見的磷酸化位點。系統(tǒng)地鑒定生殖組織中的磷酸化蛋白質和相關過程對探索花藥發(fā)育的信號傳導途徑非常有用，并且可以發(fā)現花藥發(fā)育的蛋白質相互作用網絡[18]。

Ye等[9]在擬南芥花藥發(fā)育4-7期和8-12期的研究進一步表明，酪蛋白激酶II、絲裂原活化蛋白激酶和14-3-3蛋白的磷酸化是花藥發(fā)育中的關鍵調節(jié)機制，擬南芥磷酸化蛋白的功能與水稻磷酸化蛋白質組功能相似。此外，他們發(fā)現磷酸化可能會降低活性氧清除酶的活性，并阻礙早期花藥發(fā)育過程中的油菜素類固醇信號傳導，表明其活性可能通過磷酸化而被開啟(表1)。

1.4.1在解析減數分裂時蛋白磷酸化作用方面的應用 在減數分裂時，花藥發(fā)育是開花植物的關鍵階段，蛋白質磷酸化是一種重要的翻譯后修飾，可以調節(jié)水稻中的減數分裂過程，其通過調節(jié)蛋白質活性和蛋白質相互作用，在控制信號轉導途徑中也起著至關重要的作用[18]。使用水稻雌蕊組織、水稻花藥和擬南芥花藥進行了三次大規(guī)模磷酸化蛋白質組學分析[9,18,29]，確定了水稻和擬南芥花藥中的大量蛋白質和磷酸化蛋白質，具有8 973個磷酸化位點的3 203個磷酸化蛋白在減數分裂時期的水稻花藥中被鑒定，鑒定的磷酸化蛋白的主要功能包括DNA修復、轉錄調控和信號傳導；減數分裂蛋白在內的許多蛋白在多個位點磷酸化，顯示不同的調控趨勢[4]。Ye等[18]對水稻減數分裂時期蛋白質組和磷酸化蛋白質組進行分析，發(fā)現磷酸化蛋白中的DNA修復，轉錄調節(jié)和信號轉導相關蛋白比較多，163個推定的分泌蛋白也是磷酸化的，可能在細胞間的通訊中起作用。此外，他們發(fā)現DNA合成、RNA剪接和RNA介導的DNA甲基化途徑受到磷酸化的廣泛影響。

1.4.2在解析轉錄因子磷酸化作用方面的應用

磷酸化影響真核生物中總蛋白質的約三分之一，并受蛋白激酶和蛋白磷酸酶的動態(tài)平衡作用的調節(jié)[18]。蛋白激酶和磷酸酶的可逆蛋白磷酸化調節(jié)是真核生物中最廣泛和最重要的翻譯后修飾之一，其通常通過轉錄因子(TF)磷酸化或去磷酸化介導的轉錄調節(jié)網絡。轉錄因子的活性通常受翻譯后修飾的影響，可協(xié)調各種細胞過程[9]。在擬南芥中，MAPK3/MAPK6對WRKYTF TF(WRKY33)的磷酸化是花粉發(fā)育和功能所必需的[30]。堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)轉錄因子FD通過鈣依賴性蛋白激酶的磷酸化對于其與成纖維素轉錄因子的相互作用是至關重要的[31]。此外，BIN2對擬南芥轉錄因子BES1/BZR2的磷酸化可能妨礙BES1/BZR2的細胞核轉運，從而降低了花藥和花粉發(fā)育中涉及的下游關鍵基因的表達[32, 33]。據報道，EMS1在早期花藥發(fā)育過程中起磷酸化形式的作用，盡管磷酸化位點仍未知[33]。

1.4.3在解析花粉蛋白磷酸化作用方面的應用

已有研究用擬南芥成熟花粉為材料進行磷酸化蛋白質組學分析，在成熟花粉鑒定到598個磷酸化蛋白，這些蛋白在調節(jié)代謝、蛋白質功能、蛋白質轉運、蛋白質結合、信號轉導和細胞轉運中起著關鍵作用。除此之外，還鑒定出了包括Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶、促分裂原活化蛋白激酶和受體樣激酶的許多激酶，這表明花粉表達的激酶的磷酸化在花粉發(fā)育中起重要作用[10]。對煙草成熟花粉和花粉管進行的磷酸化蛋白質組學分析，鑒定出439種磷酸化蛋白，其中大多數蛋白質與轉錄、蛋白質合成、蛋白質儲存以及信號轉導相關[21,22]。

1.5 在解析花藥蛋白乙酰化修飾方面的應用

蛋白質乙?；堑鞍追g后修飾的一種，包括組蛋白和非組蛋白的乙?；揎?，是一種普遍存在的、動態(tài)的、可逆的蛋白質翻譯后修飾方式。它參與了包括轉錄調控、信號通路調控、蛋白質穩(wěn)定性調控、細胞代謝等多個生理過程[34]。對于乙酰化的研究方式則主要有質譜鑒定、特異性乙?；贵w鑒定、標記底物為基礎的方法等。這些技術的發(fā)展為蛋白質乙酰化修飾的發(fā)現以及乙?；揎椩谏項l件下所發(fā)揮的功能的相關研究起到至關重要的作用。

蛋白賴氨酸乙?；且环N在真核生物和原核生物中發(fā)現的可逆的和動態(tài)的翻譯后修飾[35]。盡管蛋白質賴氨酸乙?；畛跏窃诮M蛋白修飾中被鑒定出來的，但是后來它被發(fā)現存在于大量的蛋白質中并且參與多個細胞過程[36,37]，例如染色質重塑和細胞周期[36]、DNA雙鏈斷裂形成[38]、細胞代謝[39]和微管的穩(wěn)定性[40]。蛋白質賴氨酸乙?；绊懡湍负蛣游锏纳嘲l(fā)育和減數分裂，但在開花植物的生殖發(fā)育過程中研究的卻比較少，特別是在某個生殖階段中[41]。Li等[42]對發(fā)現的賴氨酸乙?；鞍踪|進行了Gene Ontology(GO)分析，發(fā)現賴氨酸乙?；赡苡绊懢€粒體蛋白功能，從而影響植物的減數分裂和花藥發(fā)育。進一步對賴氨酸乙酰化蛋白質進行蛋白質結構域富集分析，發(fā)現蛋白賴氨酸乙酰化影響花藥發(fā)育的不同過程。此外，他們發(fā)現與孢粉素生物合成過程有關的蛋白質和與脂肪酸生物合成過程相關的蛋白質也被乙?；?，這兩個過程已被證明對花粉發(fā)育很重要，從而推測蛋白賴氨酸乙?；诨ǚ郯l(fā)育中起著重要的作用[41]。

2 代謝組學在花藥發(fā)育研究中的應用

代謝組學是Nicholson等[43]在1999年提出的概念，即對某一生物組分或細胞在某一特定生理時期或條件下所有代謝產物同時進行定性和定量的分析，以發(fā)現差異代謝物，進而明確某一時刻生物組分或細胞的完整生理狀態(tài)。代謝組學是繼基因組學、蛋白組學、轉錄組學之后又一門新興的組學技術，是系統(tǒng)生物學的一個重要分支。代謝組學研究可以更好地解析植物雄性不育形成和逆境脅迫下的生化機制，作為組學技術中一門新興的和不斷發(fā)展的學科，已經成為揭示生物體系變化規(guī)律的重要手段，在很多個方面得到廣泛運用。代謝組分析技術包括代謝物的分離、檢測及鑒定。目前，代謝產物的分離技術主要有氣相色譜、液相色譜和毛細管電泳等。檢測及鑒定技術主要有質譜、核磁共振、庫侖分析、傅立葉變換紅外光譜、紫外吸收、熒光散射、發(fā)射性檢測和光散射等(表2)。在實際操作中一般采用多種分離、檢測方法并用，以盡可能多地獲取代謝物組分。

Yue等[45]利用氣相色譜質譜聯用技術分析矮牽牛花藥發(fā)育的代謝變化，通過偏最小二乘法判別分析發(fā)現，參與淀粉和蔗糖代謝的果糖和葡萄糖為最重要的代謝物，說明糖信號通路可能在花藥發(fā)育中起著至關重要的作用，之前的一項研究已經證明糖信號傳導途徑可能是棉花花藥的中心信號傳導網絡，并且在高溫條件下可以抑制蔗糖轉化為果糖和葡萄糖。此外，他們對光合相關基因進行qRT-PCR分析，結果顯示其隨著花藥發(fā)育而降低的表達趨勢，說明隨著花藥的發(fā)育，能量和糖類代謝途徑的活動逐漸減少[46]。Tang等[44]使用細胞學、細胞化學和非靶向代謝組學來研究小麥花藥發(fā)育階段中存在的多糖、脂類和所有代謝物的分布特征，發(fā)現三羧酸循環(huán)和糖酵解在花藥發(fā)育期間非?；钴S，用以提供花藥和花粉發(fā)育所需的能量。

茉莉酸酯是植物應激反應和發(fā)育所需的信號組分，茉莉酮酸生物合成或信號轉導受阻會導致植物育性喪失。對番茄野生型和茉莉酸不敏感1-1(jai1-1)突變體進行花藥激素含量、轉錄組和代謝組分析發(fā)現，野生型番茄花藥表現出茉莉酮酸的短暫增加，而在jai1-1突變體中卻沒有茉莉酮酸的短暫增加。在早期花藥發(fā)育中，茉莉酮酸酯促進與花粉營養(yǎng)和水供應相關的過程。在后期發(fā)育階段，jai1-1突變體中的茉莉酸不敏感性導致乙烯信號傳導中的調節(jié)因子過早表達，這使乙烯過早合成，從而導致花藥過早開裂[47]。在擬南芥茉莉酸缺乏或不敏感突變體中，花藥的開裂被推遲，這與茉莉酸番茄的影響相反。在野生型擬南芥成熟花中，茉莉酸水平最高[49]，并且在花藥發(fā)育的第12期，雄蕊需要茉莉酸的積累以促使花絲伸長[50]，這說明茉莉酸可能作為一種正向調節(jié)劑，通過觸發(fā)擬南芥花藥發(fā)育開關，影響花藥成熟和開裂。另外，通過對桐樹花朵細胞學觀察、內源性植物激素測定和RNA-seq綜合分析發(fā)現，在雌花發(fā)育中期，水楊酸積累引發(fā)細胞程序性死亡，并阻止花藥和花粉發(fā)育，最終導致桐樹雌花中的雄蕊敗育[47]。

表2 代謝組學在花藥發(fā)育研究中的應用Table 2 Application of metabonomics in anther development research.

3 展望

在生物系統(tǒng)中，蛋白質通過與代謝物、各種RNA和其他類型蛋白質之間的復雜相互作用發(fā)揮其特定的作用。蛋白質組學與基因組學、轉錄組學、代謝組學的整合將成為未來應用的一個非常有前途的研究領域，可以為闡明分子機制提供一種方式。對植物花藥發(fā)育的蛋白質組與轉錄組研究的比較多，特別是在擬南芥和水稻中，代謝組的研究比較少，得到的數據不如蛋白質組和轉錄組多。因此，未來需要進一步詳細研究每個組學內容，更加積極研究之前沒有涉及到的領域，同時結合每個組學的數據對從基因、轉錄、蛋白和代謝水平的生物過程進行全面深入的闡釋。這將提供更大的機會來研究花藥發(fā)育中基因之間的相互作用、基因表達、蛋白質和代謝物之間的相互作用。此外，需要更多關注分離花藥特定的細胞類型，改進蛋白質、RNA以及各種代謝產物提取和鑒定方法，進行技術上的不斷革新，數據的不斷挖掘，從而推動組學技術在植物育種以及其他方面的應用。