周慧琴，徐達(dá)良，董 揚(yáng)，江家云，伊世奇

Alport綜合征(alport syndrome，AS)又稱遺傳性進(jìn)行性腎炎，臨床特點(diǎn)是以血尿、蛋白尿及進(jìn)行性腎功能減退為主，部分病人可合并出現(xiàn)感音神經(jīng)性耳聾、眼部異常、食管平滑肌瘤等腎外表現(xiàn)，是危及兒童及青少年生命健康的重要疾病之一[1-3]。隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展及各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)診療水平的提高,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。根據(jù)2008年北美兒童腎臟實(shí)驗(yàn)及合作性研究中心的數(shù)據(jù)顯示，AS患兒腎移植占同期兒童腎移植的2.3%,占同期兒童血液透析的2.3%,該病活產(chǎn)兒發(fā)病率為1∶5 000[4]。AS為編碼Ⅳ型膠原α3、α4、α5鏈的基因突變所致，其中α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)基因突變所致為常染色體顯性或隱性遺傳，α5(Ⅳ)基因突變所致為X連鎖顯性遺傳，至今為止已有超出700個(gè)基因突變被發(fā)現(xiàn)[5]。本研究采用高通量第2代測(cè)序技術(shù)對(duì)1例AS患兒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的α5鏈位點(diǎn)移碼突變，為國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患兒，女，3歲11個(gè)月，因“發(fā)現(xiàn)血尿、蛋白尿2年，水腫3 d，咳嗽1 d”于2018年12月就診于安徽省兒童醫(yī)院腎內(nèi)科。患兒入院2年前(2016年12月)曾因“肺炎”在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院住院治療時(shí)尿檢發(fā)現(xiàn)隱血陽(yáng)性，入院5個(gè)月前當(dāng)?shù)貜?fù)診復(fù)查尿檢提示尿蛋白2+，隱血3+，血清白蛋白未見異常，24 h尿蛋白未見異常，當(dāng)?shù)蒯t(yī)院診斷：血尿待查，IgA腎病可能，入院2個(gè)月前當(dāng)?shù)貜?fù)查,尿蛋白弱陽(yáng)性，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)849.9～1 274.7/μL；紅細(xì)胞形態(tài)：非均一性紅細(xì)胞；予以“黃葵膠囊”對(duì)癥處理?；純喝朐? d前出現(xiàn)咳嗽及雙眼瞼水腫伴尿少，尿色呈濃茶色。病程中無皮疹，無關(guān)節(jié)腫痛。

入院查體：體溫36.1 ℃,脈搏 110次/分，呼吸30次/分，體質(zhì)量19.9 kg，血壓108/60 mmHg,雙眼瞼水腫，咽部充血，雙肺呼吸音粗糙，可聞及中粗濕啰音，心腹查體無特殊。診斷：腎病綜合征(腎炎型)，給予積極抗感染治療后肉眼血尿緩解。建議基因檢查排除AS，送檢第2代高通量測(cè)序(北京智因東方轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，北京全譜醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室)?；純合的赣H第1胎第1產(chǎn)，足月順產(chǎn)出生，無窒息搶救史，胎盤及羊水無特殊，生長(zhǎng)發(fā)育史無異常。父母非近期婚配，均體健。否認(rèn)家族遺傳病史及傳染病接觸史。我院實(shí)驗(yàn)室檢查，尿常規(guī)：外觀微混，顏色淡紅，pH 5.5，尿蛋白3+，紅細(xì)胞5 162/μL、929/HP、非均一性小細(xì)胞，24 h尿蛋白2.11 g/L；尿敏感腎功能六項(xiàng)：尿微量白蛋白1 582.40 mg/L，尿免疫球蛋白IgG 30.2 mg/L,N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶 13.50 U/L,4-尿轉(zhuǎn)鐵蛋白110.15 mg/L；生化：白蛋白25.9 g/L,尿素6.8 mmol/L，血肌酐38.7 μmol/L；血脂分析：總膽固醇5.81 mmol/L，鈣2.15 mmol/L。肝功能正常，ASO 3.2 IU/mL,補(bǔ)體C3 1.6 g/L,補(bǔ)體C4 0.14 g/L,免疫球蛋白M 2.32 g/L,出凝血時(shí)間正常，清潔中段尿培養(yǎng)未見細(xì)菌，雙腎B超示：右腎7.0 cm×3.5 cm，左腎6.9 cm×3.4 cm,雙腎彌漫性病變。左腎靜脈彩超未見異常，純音測(cè)聽聽力無障礙，眼裂隙燈檢查及視力檢查未見異常，患兒父母及近三代尿常規(guī)未見異常。

入院后積極控制呼吸道感染予以頭孢西丁抗感染，霧化化痰；添加纈沙坦27 mg每天1次，降蛋白對(duì)癥治療?；純喊l(fā)病年齡小(1年11個(gè)月)，腎臟出現(xiàn)損害時(shí)間長(zhǎng)(2年)，考慮遺傳代謝病，需行腎活檢和基因檢測(cè)。與家長(zhǎng)溝通后于2019年1月9日腎活檢，結(jié)果提示基底膜厚薄不一，致密層增厚，部分呈撕裂狀和蛛網(wǎng)狀，建議進(jìn)一步完善基因檢測(cè)。2019年1月15日復(fù)查尿蛋白轉(zhuǎn)陰，尿敏感腎功能六項(xiàng)：尿微量白蛋白30.39 mg/L，尿免疫球蛋白IgG 2.4 mg/L,N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶 10.16 U/L,4-尿轉(zhuǎn)鐵蛋白2.75 mg/L，初期未添加激素等免疫抑制劑，臨床癥狀及輔檢較前明顯好轉(zhuǎn)，目前予以纈沙坦27 mg每天1次及百令膠囊對(duì)癥治療。4個(gè)月后復(fù)診，尿蛋白未見異常，腎功能正常，尿微量白蛋白30.00 mg/L，輕度升高。

1.2 病理研究方法 采用B超定位下經(jīng)皮腎活檢術(shù)，活檢腎組織按常規(guī)方法進(jìn)行光鏡、免疫熒光和電鏡檢查，加做IV型膠原的檢測(cè)。

1.3 DNA測(cè)序研究方法

1.3.1 基因組DNA提取 在患兒家長(zhǎng)知情同意的前提下，采集病人及父母全血 2 mL(EDTA 抗凝血)進(jìn)行基因分析?；蚪M DNA 提取：取病人新鮮外周血，使用 BloodGen Midi Kit(CWBIO,China) 提取病人全基因組 DNA，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.2 全外顯子組測(cè)序 采用 IDT 公司 xGen?Exome Research Panel v1.0捕獲芯片。Cavoris儀打斷至200 bp左右，片段化DNA 在 Klenow Fragment,T4 DNA polymerase 和T4PNK 的作用下進(jìn)行末端補(bǔ)平修復(fù)。在聚合酶體系下，使上一步得到的修復(fù)產(chǎn)物在 3′末端加上 A 堿基，為下一步連接做好準(zhǔn)備。配置T4DNA 連接酶反應(yīng)體系，在Thermo mixer 中適溫反應(yīng)一定時(shí)間使 adapter 和加“A”產(chǎn)物連接。連接產(chǎn)物經(jīng)4～6輪LM-PCR擴(kuò)增。文庫(kù)與探針混于雜交體系中 65 ℃、60～68 h雜交。使用鏈霉素磁珠，與雜交樣本孵育后洗脫液洗脫。洗脫產(chǎn)物經(jīng)10輪 LM-PCR 擴(kuò)增。Illumina hiseq xten 平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)化上機(jī)測(cè)序操作流程，測(cè)序得到圖像原始數(shù)據(jù)，Illumina官方basecall分析軟件BclToFastq得到原始數(shù)據(jù)(raw data)。去接頭污染，去低質(zhì)量的數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)與參考序列比對(duì)統(tǒng)計(jì) (比對(duì)軟件 BWA)，參考基因組： hg19基因組。SNP檢測(cè)及注釋：分析軟件 samtools。Indel檢測(cè)及注釋：分析軟件 pindel。變異假陽(yáng)性過濾：根據(jù)測(cè)序深度，變異質(zhì)量，對(duì)檢測(cè)得到的SNP、Indel進(jìn)行過濾篩選，得到高質(zhì)量可靠的變異。變異注釋：SNP和Indel根據(jù)在基因上的位置，分析得到氨基酸變化影響、剪切影響、UTR、內(nèi)含子變異影響等。使用SIFT利用基于同源比對(duì)，蛋白結(jié)構(gòu)的保守性等的算法，預(yù)測(cè)篩選出的變異對(duì)蛋白質(zhì)的影響。對(duì)剪切位點(diǎn)附近的變異，做剪切危害性預(yù)測(cè)。

1.3.3 Sanger測(cè)序驗(yàn)證 根據(jù)COL4A5基因驗(yàn)證位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s,72 ℃ 鏈延伸30 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。最后72 ℃補(bǔ)充延伸10 min。PCR的體系均為50 μL。用ABI 3730XL測(cè)序儀測(cè)序，測(cè)序引物采用原PCR引物?；蛐蛄蟹治霾捎肈NASTAR軟件進(jìn)行序列分析和比對(duì)，mRNA比對(duì)模板為 NM_033380。對(duì)點(diǎn)變異攜帶者病人及父母樣本進(jìn)行Sanger測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 腎活檢結(jié)果 綜合光鏡、免疫及電鏡結(jié)果回報(bào)：腎小球輕微病變伴個(gè)別新月體形成，C3系膜區(qū)沉積，可見19個(gè)腎小球，將熒光備片經(jīng)PASM染色，可見12個(gè)腎小球，未見腎小球球性及節(jié)段性硬化。腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)輕微增生，無明顯局灶節(jié)段性加重及內(nèi)皮細(xì)胞增生，系膜區(qū)少許嗜復(fù)紅蛋白沉積，毛細(xì)血管襻開放，熒光備片中1個(gè)細(xì)胞性新月體形成。腎小管上皮細(xì)胞空泡及顆粒變性，少數(shù)腎小管管腔擴(kuò)張，刷毛緣消失，個(gè)別腎小管萎縮，腎間質(zhì)輕度水腫，小灶狀淋巴細(xì)胞及少許嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，小動(dòng)脈管壁無明顯病變(見圖1)。免疫熒光：C3+球性系膜區(qū)呈顆粒狀沉積；a3、a5腎小管基底膜節(jié)段表達(dá)(見圖2)。超微結(jié)果：基底膜厚薄不一，基底膜致密層增厚，部分呈撕裂狀和蛛網(wǎng)狀，足突彌漫融合，少數(shù)系膜區(qū)可見少量電子致密物沉積(見圖3)。

2.2 全外顯子組測(cè)序及Sanger測(cè)序 全外顯子組測(cè)序結(jié)果顯示病人COL4A5基因49號(hào)外顯子存在c.4 518_c.4 519 insC(p.Gln1 507Profs*14)的雜合變異，通過Sanger測(cè)序證實(shí)；該變異為第48號(hào)外顯子上4 518和4 519位堿基中間插入了一個(gè)胞嘧啶，導(dǎo)致蛋白在第1 507位谷氨酰胺變異為脯氨酸后再編碼14個(gè)密碼子即終止編碼，造成合成的蛋白出現(xiàn)截短，破壞了C末端的非膠原結(jié)構(gòu)域NC1(見圖4)。另該變異在dbSNP、Hapmap、千人基因組(1000 Genomes)、ExAC、gnomAD等數(shù)據(jù)庫(kù)分布頻率均為0。根據(jù)《ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南》[6]的變異致病證據(jù)分級(jí)，病人攜帶的該變異滿足PV1+PS1+PM2的致病證據(jù)，達(dá)到致病性變異(Pathogenic)級(jí)別。同時(shí)也未檢測(cè)到病人其他腎炎相關(guān)基因的可疑致病變異。病人父母均不攜帶該變異，在該變異位置均為野生型，驗(yàn)證結(jié)果與目標(biāo)序列捕獲測(cè)序一致。

3 討論

AS是目前導(dǎo)致兒童終末期腎病(ESRD)的重要疾病之一[3]。由于遺傳性疾病現(xiàn)階段進(jìn)展至ESRD的治療方法有限，過程無法逆轉(zhuǎn)，因此兒科醫(yī)生應(yīng)高度關(guān)注，指導(dǎo)先證者家庭優(yōu)生優(yōu)育，降低患病兒童出生率，大大減輕家庭的負(fù)擔(dān)。

本例全外顯子組測(cè)序結(jié)果顯示病人COL4A5基因49號(hào)外顯子存在c.4518_c.4519 insC(p.Gln1507Profs*14)的雜合變異，通過Sanger測(cè)序證實(shí)。變異造成NC結(jié)構(gòu)域的缺陷可能會(huì)引起Ⅳ型膠原蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)異常，致使基底膜不能分離和支撐許多組織中的細(xì)胞行為而發(fā)病，詳細(xì)的致病機(jī)制需要進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)來探究。WANG等[7]發(fā)現(xiàn)COL4A5基因移碼變異導(dǎo)致的X連鎖AS的一個(gè)大家庭，且該家庭的任何病人都沒有眼睛或聽力異常，僅僅有腎臟病變，沒有腎外病變，與本例病人情況類似。本例病人父母該變異均為野生型，也符合孟德爾遺傳規(guī)律。經(jīng)檢索Human Gene Mutation Database、Clinical Genome Resource、Pubmed和萬(wàn)方、知網(wǎng)等數(shù)據(jù)庫(kù)，均未收錄COL4A5基因的該變異，為未見報(bào)道的新的變異，該先證者基因位點(diǎn)為首次報(bào)道新位點(diǎn)，豐富了目前COL4A5基因移碼突變譜及表型信息。

COL4A5基因突變位點(diǎn)與臨床表現(xiàn)嚴(yán)重程度分為3類：嚴(yán)重型(S型)、中度-重度嚴(yán)重型(M-S型)和中度型(M型)。S型青少年期起病，年齡在20歲以下，80%患兒伴有聽力異常，40%患兒伴有視覺異常，為大片段重組或者提前終止翻譯或者移框突變或者N端序列突變等。M-S型在26歲前進(jìn)展至ESRD，腎外系統(tǒng)受累較少，主要基因異常在21～47號(hào)外顯子區(qū)發(fā)生甘氨酸替代突變，非甘氨酸錯(cuò)義突變和框內(nèi)或受體剪切位點(diǎn)突變等。M型則在1～20號(hào)外顯子區(qū)，在30歲后進(jìn)展至ESRD，70%病人伴有聽力喪失，最多30%病人伴有眼部病變。結(jié)合本例先證者移碼突變位于第48號(hào)外顯子上，患兒發(fā)病年齡早(1歲11個(gè)月)，臨床表現(xiàn)腎臟損害嚴(yán)重(腎病綜合征合并肉眼血尿)，由于患兒年幼(3歲11月)，目前腎外受累不明顯，考慮為S型。

有學(xué)者[8]建議對(duì)每一個(gè)AS家系均進(jìn)行遺傳型診斷，以利于對(duì)先證者進(jìn)行預(yù)后評(píng)估和先證者及其家系進(jìn)行遺傳咨詢。AS病人子代患病的概率是有規(guī)律可循的：女性病人與正常男性婚配，其子女各1/2發(fā)??；男性病人與正常女性婚配，女兒都是病人，兒子正常。常染色體隱性遺傳性者：病人雙親無?。煌?/4發(fā)病，男女機(jī)會(huì)相等，病人發(fā)生在同一代；近親婚配者發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)大大增高。AS病人大多數(shù)于青壯年時(shí)期發(fā)展至ESRD，需要透析和腎移植治療。因此對(duì)于AS這樣一種預(yù)后差的遺傳性腎臟病，早期、正確的診斷十分重要。

(致謝 北京智因東方轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心王亞健老師在實(shí)驗(yàn)技術(shù)及基因分析方面的幫助)