刁慧杰，劉 芳，李金穎，崔 紅

0引言

目前，我國(guó)糖尿病確診人數(shù)超過(guò)9 000萬(wàn)，隱性患者近1.5億人。隨著我國(guó)人民壽命的提高和生活水平不斷改善，糖尿病的發(fā)生呈快速上升趨勢(shì)。糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，糖尿病病史10a患者中糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病率為50%，糖尿病病史超過(guò)20a的患者中，糖尿病視網(wǎng)膜病變的患病率幾乎為100%。糖尿病患者體內(nèi)長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)引起蛋白激酶C、糖基化血紅蛋白及多元醇代謝產(chǎn)物增加，影響了視網(wǎng)膜的生理功能并啟動(dòng)了氧化應(yīng)激損傷[1-2]。無(wú)論是糖尿病大鼠模型還是高糖培養(yǎng)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，均顯示視網(wǎng)膜脂質(zhì)過(guò)氧化物水平顯著升高，抗氧化酶水平減低。褪黑素(melatonin, MLT)因其對(duì)糖尿病患者的葡萄糖和脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)代謝作用而被廣泛認(rèn)可。我們將褪黑素引入到糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療中，也是基于其有效降低脂質(zhì)過(guò)氧化物水平、減輕氧化應(yīng)激損傷的功效[3]。褪黑素對(duì)糖尿病患者及糖尿病動(dòng)物模型的調(diào)節(jié)糖脂代謝及抗氧化的作用已受到廣泛重視，但是，關(guān)于褪黑素對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜組織影響的相關(guān)報(bào)道較少。本研究建立了糖尿病大鼠模型，觀察褪黑素對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的保護(hù)作用并探討了其作用機(jī)制。

1材料和方法

1.1材料褪黑素(Sigma-Aldrich公司，用無(wú)水乙醇溶解)；DMEM培養(yǎng)液(Hyclone公司)；4%多聚甲醛及2.5%戊二醛(北京索萊寶科技有限公司)；1%鋨酸(上海哈靈生物科技有限公司)；枸櫞酸鉛和2%醋酸雙氧鈾(上海容創(chuàng)生物技術(shù)有限公司)；手術(shù)顯微鏡(德國(guó)Leica公司，型號(hào)：M525 F40)；切片機(jī)(德國(guó)Leica公司，型號(hào)：EM UC7)；倒置生物顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠，型號(hào)：37XF)；電泳儀(北京六一生物科技有限公司，型號(hào)：DYCZ-40D)；蘇木素-伊紅染色劑(武漢博士德生物工程有限公司)；BCA蛋白測(cè)定試劑盒、裂解液、PVDF膜及化學(xué)發(fā)光試劑、B細(xì)胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma/lewkmia-2, Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X Protein, Bax)及P53抗體(上海碧云天公司)。

1.2方法

1.2.1糖尿病大鼠模型制備及干預(yù)清潔級(jí)雄性SD大鼠[牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(黑)2015-007]40只，體質(zhì)量160±20g，清潔級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)，喂養(yǎng)期間提供標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼料，自由飲水進(jìn)食，符合衛(wèi)生部頒布的《衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則》和《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的規(guī)定。隨機(jī)分為正常對(duì)照組、糖尿病組、低劑量褪黑素組和高劑量褪黑素組，每組10只，所有大鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1wk。糖尿病組、低劑量褪黑素組和高劑量褪黑素組大鼠禁食12h后按照腹腔內(nèi)注射60mg/kg鏈脲佐菌素建立糖尿病模型，正常對(duì)照組注射等量的生理鹽水。72h后自動(dòng)血糖分析儀檢測(cè)尾靜脈血糖，濃度>16.7mmol/L視為糖尿病模型制備成功，造模未成功的大鼠繼續(xù)補(bǔ)充注射鏈脲佐菌素72h，最終30只大鼠均造模成功。造模成功后的大鼠均在第2d注射褪黑素，其中，低劑量褪黑素組大鼠每天左下腹腔注射褪黑素10mg/kg，高劑量褪黑素組大鼠每天左下腹腔注射褪黑素20mg/kg[4-6]，正常對(duì)照組和糖尿病組大鼠不做任何治療，每日1次，連續(xù)喂養(yǎng)12wk。

1.2.2取材及視網(wǎng)膜病理改變的觀察大鼠過(guò)量麻醉處死，在解剖顯微鏡下無(wú)菌操作取右眼眼球，分離視網(wǎng)膜組織，分成2份。其中，1份視網(wǎng)膜用于HE染色，另1份視網(wǎng)膜浸于DMEM培養(yǎng)液中，4℃保存以備用。HE染色具體方法：4%多聚甲醛固定24h，制備石蠟切片并染色蘇木素5～10min，蒸餾水沖洗后伊紅染液5～10min，再次用蒸餾水洗去玻片浮色，梯度乙醇溶液脫水后觀察視網(wǎng)膜病理改變。大鼠左側(cè)眼球置于戊二醛(2.5%)固定液內(nèi)，4℃冰箱固定72h以上，留作制備電鏡標(biāo)本。

1.2.3電鏡觀察視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞改變?nèi)〕鑫於┕潭ㄒ褐醒矍颍蛛x視網(wǎng)膜組織，室溫下1%鋨酸固定2h，丙酮脫水，常規(guī)電鏡包埋，制作超薄切片，枸櫞酸鉛和2%醋酸雙氧鈾染色，透射電鏡觀察。

1.2.4視網(wǎng)膜組織中SOD及MDA水平檢測(cè)各組取50μg視網(wǎng)膜組織，研磨制成組織勻漿后低速離心(2 000r/min)，取上清液，按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明將樣品加樣、混勻，采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD及MDA水平。

1.2.5 Western Blot檢測(cè)Bcl-2、Bax及P53的蛋白表達(dá)水平取50μg視網(wǎng)膜組織，冰上加入400μL含有蛋白酶抑制劑的裂解液研磨30min以提取總蛋白，10 000r/min離心10min后取上清，行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后5%的脫脂奶粉4℃封閉2h，加一抗(稀釋濃度1∶1000)過(guò)夜，室溫下孵育二抗(稀釋濃度1∶2000)1h，ECL化學(xué)發(fā)光法自顯影并采集圖像，利用樣本目的蛋白的光密度比內(nèi)參條帶的光密度，比較不同樣本的相對(duì)表達(dá)率。

2結(jié)果

2.1 HE染色觀察大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)、外核層細(xì)胞排列規(guī)整；糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜組織層次欠清晰，神經(jīng)纖維層水腫，內(nèi)叢狀層及內(nèi)、外核層排列疏松；低劑量褪黑素組視網(wǎng)膜細(xì)胞分層基本分明，層間細(xì)胞排列較整齊，內(nèi)外核層排列稍紊亂；高劑量褪黑素組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)較低劑量褪黑素組進(jìn)一步改善，見(jiàn)圖1。

2.2電鏡觀察大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞漿豐富，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，核內(nèi)染色質(zhì)均勻；糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞漿顯著減少，細(xì)胞核腫脹，染色質(zhì)稀疏，線粒體腫脹并呈空泡樣改變；褪黑素組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)不同程度改善，其中，低劑量褪黑素組細(xì)胞內(nèi)仍可見(jiàn)線粒體空泡樣改變，細(xì)胞核形態(tài)略規(guī)整；高劑量褪黑素組胞漿豐富，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，核仁結(jié)構(gòu)清晰，見(jiàn)圖2。

2.3各組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD及MDA水平如表1所示，與正常對(duì)照組相比，糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD水平明顯降低，MDA水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與糖尿病組相比，低劑量褪黑色素組和高劑量褪黑色素組SOD水平明顯升高，MDA水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 光學(xué)顯微鏡下各組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu) (HE染色×400) A:正常對(duì)照組;B:糖尿病組;C:低劑量褪黑素組;D高劑量褪黑素組。

圖2 電鏡觀察大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變(×5 000) A:正常對(duì)照組;B:糖尿病組;C:低劑量褪黑素組;D高劑量褪黑素組。

圖3 Western blot檢測(cè)各組視網(wǎng)膜組織中Bcl-2、Bax及P53蛋白表達(dá)。

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD及MDA水平

2.4各組大鼠視網(wǎng)膜組織凋亡蛋白表達(dá)水平比較如圖3和表2所示，與正常對(duì)照組相比，糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜組織Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低，Bax和P53蛋白表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與糖尿病組比較，低、高劑量褪黑素組Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高，高劑量褪黑素組Bax及P53蛋白表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)結(jié)果

3討論

褪黑素可直接淬滅活性氧自由基，有良好的抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗凋亡活性[7-9]。李曉艷等[10]研究表明，褪黑素對(duì)糖尿病大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，其作用機(jī)制與抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。褪黑素具有脂溶性和水溶性，細(xì)胞膜及線粒體膜均由脂質(zhì)構(gòu)成，這種雙重溶解性的特點(diǎn)允許藥物可以有效通過(guò)血-眼屏障及血-房水屏障，在眼部發(fā)揮足夠的藥效[11]。本研究也是利用了褪黑素雙重溶解的特點(diǎn)，以無(wú)水乙醇溶解褪黑素，保證藥物充分溶解又能達(dá)到有效作用濃度。此外，褪黑素由松果體分泌，具有無(wú)毒特性，應(yīng)用于眼部相對(duì)安全，這些特性為褪黑素用于視網(wǎng)膜疾病的臨床實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)[12]。在本實(shí)驗(yàn)中我們采用腹腔注射的方式給藥，是考慮到視網(wǎng)膜組織供血來(lái)自頸外動(dòng)脈，大鼠每天左下腹腔注射褪黑素后，可通過(guò)體循環(huán)-左心室-主動(dòng)脈-頸外動(dòng)脈-眼動(dòng)脈方式到達(dá)視網(wǎng)膜組織，保證了視網(wǎng)膜整體組織藥物的有效性?，F(xiàn)階段我們通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該藥物對(duì)視網(wǎng)膜組織的保護(hù)作用，后續(xù)將繼續(xù)通過(guò)局部用藥方式(眼內(nèi)注射或滴眼劑)，進(jìn)一步證實(shí)該藥物有效性。

視網(wǎng)膜由視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層及RPE層構(gòu)成，RPE層由單層排列的RPE細(xì)胞構(gòu)成，任何原因引起的RPE損傷都會(huì)對(duì)視功能造成不可逆影響[13]。視網(wǎng)膜對(duì)氧化應(yīng)激高度敏感，糖尿病患者視網(wǎng)膜組織氧化應(yīng)激水平升高，影響了視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層及RPE層的正常生理功能[14]。本研究使用60mg/kg鏈脲佐菌素大鼠腹腔內(nèi)注射建立糖尿病大鼠模型，觀察褪黑素對(duì)視網(wǎng)膜組織的保護(hù)作用。

觀察結(jié)果顯示，褪黑素干預(yù)的糖尿病大鼠，其視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)要優(yōu)于糖尿病組大鼠。糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜組織層次欠清晰，神經(jīng)纖維層水腫，內(nèi)叢狀層及內(nèi)、外核層排列疏松；褪黑素干預(yù)后，視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列較規(guī)整；電鏡對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察顯示，低、高劑量褪黑素組細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞內(nèi)線粒體空泡樣改變均較糖尿病組減輕，表明褪黑素干預(yù)可保護(hù)正常視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)。

SOD及MDA是機(jī)體內(nèi)主要的抗氧化酶，其中，SOD與自由基清除能力正相關(guān)，MDA含量高低可反映自由基水平[15]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，褪黑素干預(yù)糖尿病大鼠能夠提高SOD水平，降低MDA含量，從而減輕病理狀態(tài)下的組織氧化損傷。

Bcl-2在氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡反應(yīng)中起重要作用，是調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑的重要分子，具有潛在的抗凋亡作用[16]。Bax及P53表達(dá)水平的高低直接反應(yīng)細(xì)胞凋亡程度[17]。糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜組織內(nèi)Bcl-2表達(dá)降低，Bax及P53表達(dá)升高，表明鏈脲佐菌素可誘導(dǎo)組織凋亡；褪黑素干預(yù)后Bcl-2表達(dá)增加，Bax及P53表達(dá)降低，進(jìn)一步證實(shí)褪黑素可抑制高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜組織凋亡。

關(guān)于褪黑素對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織保護(hù)作用的研究并不多見(jiàn)。國(guó)內(nèi)學(xué)者通過(guò)制備2型糖尿病大鼠模型，研究褪黑素對(duì)視網(wǎng)膜組織的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，褪黑素能有效減輕糖尿病大鼠視網(wǎng)膜局部氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡[18]。本研究通過(guò)觀察視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)，檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中SOD、MDA、Bcl-2、Bax、及P53表達(dá)水平進(jìn)一步驗(yàn)證了褪黑素對(duì)高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜組織損傷的保護(hù)作用，為預(yù)防和治療糖尿病視網(wǎng)膜病變提供了新的干預(yù)措施。