彭佳媛，杜旌暢，鐘 茜，劉婷婷，楊利瓊，吳藹林，陳 瑋，朱彥鋒，余小平

0引言

光污染(light pollution)廣泛存在于生活環(huán)境中，其導致的視網(wǎng)膜損傷已逐漸成為較嚴重的公共衛(wèi)生問題[1]。研究證實，短時強光或長時弱光照射對視網(wǎng)膜可造成光化學損傷、熱損傷和機械損傷，其中以視網(wǎng)膜光化學損傷(retina photochemical damage，RPD)為主[2]。流行病學研究表明[3]，光損傷導致的視網(wǎng)膜疾病在未來20a將增加1倍，因而研究RPD的有效預防途徑顯得尤為迫切?；ㄇ嗨?anthocyanin)是一組天然黃酮類化合物，廣泛存在于有色蔬果中，具有多種生物活性，包括抗氧化[4-5]、抗炎[6-7]、抑癌[8]和神經(jīng)保護[9]作用?；ㄇ嗨刂饕?種單體，即飛燕草素(delphinidin，Dp)、花葵素(pelargonidin)、錦葵花素(malvidin)、矢車菊素(cyanidin)、芍藥花青素(peonidin)、矮牽牛素(petunidin)，其中以花色苷Dp豐度較高，且羥基數(shù)量較多，其抗氧化生物特性高于其它單體[10-11]。我們前期研究[12-13]證實，黑米花青素能通過抗氧化、抗凋亡途徑防護RPD，Dp是黑米花青素的主要活性成分，但是否能有效防護RPD尚不清楚。本研究以661W小鼠視網(wǎng)膜感光細胞和Sprague-Dawley(SD)大鼠為研究對象，從體內(nèi)和體外角度探討Dp是否通過調(diào)節(jié)氧化-抗氧化系統(tǒng)防護RPD。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗細胞和動物661W感光細胞購自上海奧陸生物有限公司(來源于美國俄克拉何馬州大學)。健康SPF級成年SD大鼠購自成都達碩實驗動物有限公司[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2015-030]，體質(zhì)量200±20g，飼養(yǎng)于SPF實驗動物屏障環(huán)境。本研究符合動物倫理學要求，經(jīng)倫理委員會審批通過。

1.1.2試劑和儀器主要試劑：Dp(美國Sigma公司，Dp為不溶于水的干粉，用DMSO配制成80mmol/L母液，-80℃保存)；DMEM培養(yǎng)基、青霉素G、鏈霉素、胰蛋白酶(美國Hyclone公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；CCK-8試劑盒(日本同仁公司)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)檢測試劑盒(中國南京建成公司)；硫代巴比妥酸活性物質(zhì)(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)(大鼠、小鼠)、LDH/SOD/GSH(大鼠)ELISA試劑盒(中國南京森貝伽公司)；谷胱甘肽巰基轉移酶(glutathione S-transferase，GST)試劑盒、RIPA裂解液(中國Solarbio公司)；BCA(美國Thermo公司)。主要儀器：CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)；細胞光照儀(自制)；CMC-01多功能光照箱(自制)；IX71倒置熒光相差顯微鏡(日本Olympus)；Power Wave XS2酶標儀(美國BioTek)；石蠟切片機(德國LEICA RM2235)。

1.2方法

1.2.1 661W細胞培養(yǎng)及分組661W細胞用含10%胎牛血清、青霉素G(100IU)和鏈霉素(100μg/mL)的高糖DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，每3～4d用胰蛋白酶消化傳代1次，收集對數(shù)生長期的細胞進行分組處理。(1)正常對照組：置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)24h更換新培養(yǎng)基，繼續(xù)保持原條件培養(yǎng)24h；(2)光照處理組：置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，2 000Lx強度白色熒光持續(xù)光照24h，更換新培養(yǎng)基，繼續(xù)保持原條件光照24h；(3)Dp處理組：置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，2 000Lx強度白色熒光持續(xù)光照24h，將Dp處理組的3組細胞分別更換為含5、10、20μmol/L濃度Dp的培養(yǎng)基，繼續(xù)光照24h[9，14]。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞活性收集對數(shù)生長期的細胞，根據(jù)實驗分組接種細胞至96孔培養(yǎng)板，每孔加入200μL細胞懸液(5×104個/mL)。根據(jù)各組處理方法處理細胞后參考CCK-8試劑盒說明書，每孔加入新鮮配置的CCK-8溶液(培養(yǎng)基總體積的10%)，同時設3個空白復孔，繼續(xù)培養(yǎng)2h后在酶標儀450nm波長處測定光吸收值。

1.2.3細胞LDH、TBARS、SOD、GSH-Px、GST含量或活力測定制備處于對數(shù)期的661W細胞懸液(2×106個/mL)，分別接種于5個T75培養(yǎng)瓶中，每瓶8mL，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。根據(jù)各組處理方法處理細胞后，于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，收集各組細胞上清液，-80℃保存，BCA法測定蛋白濃度，按LDH試劑盒說明書檢測其活力。然后收集細胞，低溫離心，超聲粉碎，低溫提取蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，嚴格按照TBARS、SOD、GSH-Px、GST試劑盒說明書檢測TBARS含量以及抗氧化酶系(SOD、GSH-Px、GST)活性。

圖1 Dp對光損傷后細胞活性的影響 bP<0.01 vs光照處理組。

1.2.4 RPD動物模型的建立和分組將60只SD大鼠隨機分為正常對照組、光照組和Dp處理組，每組各20只。對照組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)30d；光照組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)29d后以3 000Lx光照處理24h；Dp處理組大鼠先以Dp[100mg/(kg·d)]每日一次灌胃給藥28d，停藥暗適應24h后以3 000Lx光照處理24h[12-13]。

1.2.5大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學觀察脫頸椎處死大鼠后摘取左側眼球，用預冷的生理鹽水洗去浮血，濾紙吸干后置于4%多聚甲醛中固定2h，常規(guī)脫水，浸蠟、石蠟包埋，經(jīng)視神經(jīng)矢狀縱切，制成厚度5μm的切片。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，0.01mmol/L PBS緩沖液漂洗1次，5min；蘇木精染色5min，自來水沖洗1min；1%鹽酸-70%乙醇分色30s，自來水沖洗或浸泡30min至切片變藍色；1%伊紅溶液染色10min。梯度乙醇脫水：75%乙醇1min，85%乙醇3min，95%乙醇7min，100%乙醇Ⅰ 10min，100%乙醇Ⅱ 10min。二甲苯透明：二甲苯Ⅰ 20min，二甲苯Ⅱ 20min。中性樹膠封片，晾干，于倒置光學顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜形態(tài)。

1.2.6抗氧化指標檢測脫頸椎處死大鼠后摘取右側眼球，用預冷的生理鹽水洗去浮血，濾紙吸干后，剝?nèi)∫暰W(wǎng)膜，置于預冷的細胞裂解液機械勻漿，4℃下3 000r/min離心10min。提取視網(wǎng)膜組織蛋白，BCA法檢測蛋白含量。按南京森貝伽公司ELISA試劑盒說明書檢測各組大鼠視網(wǎng)膜TBARS、SOD、GSH-Px、GST含量。

2結果

2.1 Dp對光損傷后細胞活性的影響CCK-8法檢測結果顯示，正常對照組、光照處理組、Dp處理組(5、10、20μmol/L濃度Dp)細胞活性(OD值)分別為3.280±0.075、1.690±0.201、3.405±0.168、3.398±0.360、2.587±0.012，差異有統(tǒng)計學意義(F=40.092，P<0.001)。與正常對照組相比，光照處理組細胞活性明顯下降(P<0.01)；與光照處理組比較，Dp處理組細胞活性均明顯升高(P<0.01)，且呈劑量相關性(圖1)。

圖2 Dp對光損傷后細胞形態(tài)的影響(×100) A：正常對照組：細胞生長旺盛，排列緊密；B：光照處理組，細胞皺縮，大量脫落；C：5μmol/L Dp處理組：細胞脫落較少；D：10μmol/L Dp處理組：細胞脫落較少；E：20μmol/L Dp處理組：細胞脫落較多。箭頭所指為死亡細胞。

圖3 Dp對光損傷后細胞LDH、TBARS、SOD、GSH-Px、GST的影響 A：LDH；B：TBARS；C：SOD；D：GSH-Px；E：GST。aP<0.05，bP<0.01 vs 光照處理組。

表1 Dp對光損傷后細胞LDH、TBARS、SOD、GSH-Px、GST的影響

2.2 Dp對光損傷后細胞形態(tài)的影響倒置顯微鏡下觀察，正常對照組細胞生長良好。光照48h后細胞大量脫落、死亡，懸浮于培養(yǎng)基中，且存活細胞的胞壁出現(xiàn)皺縮，貼壁生長能力降低。不同濃度Dp處理組細胞的數(shù)量和貼壁能力明顯較光照處理組升高，且該升高趨勢呈現(xiàn)Dp劑量相關性(圖2)。

2.3 Dp對光損傷后細胞LDH、TBARS、SOD、GSH-Px、GST的影響正常對照組、光照處理組、Dp處理組(5、10、20μmol/L濃度Dp)細胞LDH活力、TBARS含量及SOD、GSH-Px、GST活性差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001，表1)。光照處理組細胞LDH活力較正常對照組明顯增高(P<0.01)，而Dp處理組細胞LDH活力均較光照處理組顯著降低(P<0.01)，且呈劑量相關性。與正常對照組相比，光照處理組細胞TBARS含量明顯升高，SOD、GSH-Px、GST活力均明顯降低(P<0.01)，經(jīng)不同濃度Dp處理后，各組細胞TBARS含量均降低；SOD、GSH-Px、GST活性均升高(P<0.01)，且具有劑量依賴性(圖3)。

2.4各組大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學結構倒置光學顯微鏡下觀察各組大鼠視網(wǎng)膜結構發(fā)現(xiàn)，光照損傷會導致大鼠視網(wǎng)膜外核層細胞間隙增大，光感受器細胞結構紊亂，外核層厚度變薄，而Dp可保護大鼠視網(wǎng)膜結構(圖4)。

2.5各組大鼠視網(wǎng)膜組織TBARS、SOD、GSH-Px、GST變化正常對照組、Dp處理組、光照處理組的大鼠視網(wǎng)膜組織中TBARS、SOD、GSH-Px、GST含量差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001，表2)。與正常對照組相比，光照處理組的大鼠視網(wǎng)膜組織中TBARS含量上升，SOD、GSH-Px、GST含量均下降(P<0.01)；與光照處理組相比，Dp處理組的大鼠視網(wǎng)膜組織中TBARS含量下降，SOD、GSH-Px、GST含量均升高(P<0.01，圖5)。

圖4 各組大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學結構(A～C×200，D～F×400) A、D：正常對照組，外核層中感光細胞致密、排列有序；B、E：Dp處理組，外核層中感光細胞排列較為有序，細胞數(shù)量較多；C、F：光照處理組，外核層中感光細胞排列松散，細胞數(shù)量減少，外核層厚度變薄。箭頭所示為大鼠視網(wǎng)膜外核層。

圖5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織TBARS、SOD、GSH-Px、GST變化 A：TBARS；B：SOD；C:GSH-Px；D：GST。bP<0.01 vs 光照處理組。

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織TBARS、SOD、GSH-Px、GST變化

3討論

視覺的形成需要一定光量刺激視網(wǎng)膜，視網(wǎng)膜病變尤其是視錐細胞損傷會導致夜盲和視野縮窄，最終導致中心視力嚴重受損，然而視錐細胞繼發(fā)損傷的病理機制卻仍未明確。近年來，本課題組[12-13]及其他研究[2，15]均證實，在3 000Lx連續(xù)光照下，視紫紅質(zhì)可吸收過量光子產(chǎn)生較多自由基，進而使膜結構(盤膜、線粒體膜、核膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜)中的脂類發(fā)生過氧化連鎖反應，形成脂質(zhì)過氧化物和活性氧介質(zhì)(reactive oxygen intermediate，ROI)，組織內(nèi)過氧化產(chǎn)物累積會導致視錐細胞發(fā)生氧化應激損傷。本研究中過度光照導致661W細胞形態(tài)發(fā)生改變，CCK-8檢測結果表明，細胞活力明顯下降，并釋放大量LDH，與陳勝等[16]和Zhou等[17]研究結果一致，說明過度光照會抑制細胞活力，誘導細胞受損。光照后661W細胞和大鼠視網(wǎng)膜組織中脂質(zhì)過氧化TBARS明顯上調(diào)，與Izawa等[18]采用小鼠構建RPD模型后檢測視網(wǎng)膜組織中TBARS結果相似，表明過度光照會導致視網(wǎng)膜組織中TBARS含量增加。SOD、GSH-Px、GST是體內(nèi)重要的抗氧化酶系，對機體的氧化與抗氧化平衡起到至關重要的作用[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，光照后661W細胞和大鼠視網(wǎng)膜組織中抗氧化酶系(SOD、GSH-Px、GST)活性降低，說明光照促使視網(wǎng)膜細胞氧化應激水平升高，打破視網(wǎng)膜中氧化-抗氧化系統(tǒng)平衡，損傷感光細胞形態(tài)，長期光損傷可導致視網(wǎng)膜光感受器丟失，是視網(wǎng)膜變性發(fā)生和發(fā)展的高危因素。

氧化應激不是視網(wǎng)膜功能障礙和變性發(fā)展的唯一因素，其它因素如炎癥、血管改變和細胞變性等也是導致視網(wǎng)膜疾病發(fā)生發(fā)展的主要因素，但減少氧化應激已被公認為是視網(wǎng)膜疾病的有效的姑息治療方法。黃體酮、硫辛酸(lipoic acid，LA)和蘿卜硫素(sulforaphane，SFN)是常用的臨床前研究該類疾病的抗氧化劑。黃體酮可減少自由基引起的損傷[21]，增加抗氧化酶SOD的表達[22]，還可通過清除細胞內(nèi)自由基減少脂質(zhì)過氧化，抑制氧化應激[23]；LA是親水親脂分子，其能在水和脂質(zhì)環(huán)境中發(fā)揮抗氧化和抗炎作用[24]。視網(wǎng)膜光損傷的體內(nèi)研究證實，SFN能促進核因子NF-E2相關因子(nuclearfactor erythroidderived 2-like 2，Nrf2)和硫氧還蛋白-1(thioredoxin-1，Trx1)的表達，具有抗Caspase活性，抑制氧化后炎癥反應的作用[25]。

目前，關于視網(wǎng)膜功能障礙治療的研究中使用的抗氧化劑種類頗多，但均未涉及天然化合物花色苷。Dp被認為是花青素中的一種高效抗氧化劑[26-27]。新近研究發(fā)現(xiàn)，Dp能通過抗活性氧(reactive oxygen species，ROS)依賴性的氧化應激反應保護骨髓源性肝干細胞(BDHSCs)[28]。Ogawa等[14]也發(fā)現(xiàn)，Dp能顯著減少光損傷后661W細胞中ROS含量。本研究發(fā)現(xiàn)，在光照后的661W細胞中加入不同濃度的Dp處理24h，鏡下觀察和CCK-8檢測結果顯示，細胞的數(shù)量和活性明顯升高，且該升高趨勢呈現(xiàn)Dp劑量相關性(尤其在5～10μmol/L升高明顯)；661W細胞釋放出的LDH檢測結果中，Dp明顯降低了LDH活性，呈劑量相關性(5μmol/L降低效果最明顯)，說明Dp具有抗光誘導的661W細胞損傷的作用。另外，我們還發(fā)現(xiàn)Dp處理后，細胞內(nèi)過氧化物產(chǎn)物TBARS在Dp濃度為10～20μmol/L內(nèi)下降明顯，抗氧化酶體系(SOD、GSH-Px、GST)活性均在Dp濃度為5μmol/L升高明顯，動物實驗進一步證實Dp能通過調(diào)節(jié)氧化-抗氧化系統(tǒng)防護RPD，與課題組前期研究動物體內(nèi)花青素防護RPD結果一致[12-13]。此外，課題組前期體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)花青素能夠升高核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)活性，同時降低Caspase-1表達，抑制感光細胞凋亡，Dp是否具備同樣的功效，值得我們進一步探討。

綜上所述，本研究通過構建RPD的體外細胞模型和體內(nèi)動物模型發(fā)現(xiàn)，Dp可以降低光損傷后細胞內(nèi)過氧化物產(chǎn)物TBARS含量，提高抗氧化酶系(SOD、GSH-Px、GST)活性，說明Dp對光誘導的視網(wǎng)膜的氧化應激損傷具有防護作用，為研究與光感受器細胞氧化損傷相關的視網(wǎng)膜疾病的發(fā)病機制和植物化學藥物調(diào)控眼科疾病的研究提供了實驗依據(jù)。