王晶珂，謝新宇，張煒，王崔巖，冷鳳，李敏*

( 華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司 河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心微生物藥物國家工程研究中心，石家莊 050015)

阿尼芬凈(Anidulafungin)是一種新型抗真菌抗生素，它是第三代棘白菌素類半合成抗真菌藥，該類藥物可靶向作用于真菌細(xì)胞壁，通過抑制β-葡聚糖的合成來殺滅真菌[1]，具有殺菌活性強、毒性低、不良反應(yīng)少等特點[2]，是一種治療真菌感染非常有效的藥物，尤其是在治療頑固深部真菌感染方面有很好的效果[3]。阿尼芬凈具有強大的體內(nèi)和體外抗菌活性，與其他棘白菌素類抗真菌藥相比，阿尼芬凈具有更大的分布容積和更廣譜的抗菌活性[4]，其合成前體(Echinocandin B Nucleus,ECBN)是棘白霉素B(Echinocandin B，ECB)在猶他游動放線菌(Actinoplanes utahensis)代謝產(chǎn)生的脫酰酶作用下，脫去不飽和脂肪側(cè)鏈得到的產(chǎn)物[5]，結(jié)構(gòu)式見圖1。

ECBN的結(jié)晶是阿尼芬凈母核制備過程中最為關(guān)鍵的一個步驟，其結(jié)晶質(zhì)量直接決定了后續(xù)納米微球純化步驟的難易程度，對終產(chǎn)品阿尼芬凈質(zhì)量也會有很大影響。ECBN結(jié)晶條件復(fù)雜，可選溶劑多，本文探討了ECBN濃縮液在低級醇-丙酮體系中結(jié)晶對純化效果的影響，摸索出了最佳純化條件。

圖1 棘白霉素B母核結(jié)構(gòu)式

1 實驗

1.1 實驗原料、試劑及設(shè)備

島津LC-2010A HT型高效液相色譜儀；真空干燥箱。

磷酸氫二甲；乙醇；丙酮；冰醋酸均為分析純；乙腈(色譜純)，美國Merck公司，三氟乙酸(色譜純)，美國Merck公司；去離子水，自制；ECBN濃縮液(10萬單位)，自制，通過發(fā)酵液預(yù)提取得到；棘白霉素B母核標(biāo)準(zhǔn)品，自制，批號：S201808，含量89.6%。

2 方法

2.1 棘白霉素B母核濃縮液制備方法

棘白霉素B母核濃縮液是其發(fā)酵液經(jīng)過濾、吸附解吸、濃縮等步驟預(yù)提取得到，制備的濃縮液的色譜純度為87.68%，含量64.24%，濃縮液為10W單位。

2.2 色譜方法

1色譜純度方法：色譜柱：H y p e r s i l C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動相 水：乙腈：三氟乙酸=96:4:0.02；流速1.0ml/min；進(jìn)樣量：5μL；柱溫40℃；檢測波長210nm；運行時間：30min，進(jìn)樣濃度：200-500μg/mL。

2含量測定方法：通過與標(biāo)準(zhǔn)品對照，根據(jù)色譜方法峰面積計算得到。

2.3 實驗方法

將乙醇和丙酮按照特定的比例混合均勻，下文將其稱之為混合液，將ECBN濃縮液(10W單位)用蠕動泵勻速滴加到盛有混合液的結(jié)晶器中，滴加完畢后繼續(xù)攪拌2h，在1～5℃下放置12h，抽濾，在45℃真空烤干得到干粉，液相檢測其色譜純度，并計算含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 選擇混合液

ECBN易溶于水，微溶于低級醇類，不溶于丙酮，ECBN在純丙酮中結(jié)晶純化效果差，結(jié)晶液在純丙酮中分散困難，甚至有結(jié)塊現(xiàn)象出現(xiàn)，因此考慮用低級醇/丙酮混合液結(jié)晶，優(yōu)化結(jié)晶過程和效果。

混合液的成分對純化效果有很大影響，分別采用甲醇/丙酮、乙醇/丙酮、異丙醇/丙酮作為混合液，將濃縮液勻速加入混合液中，考察不同醇類對純化效果的影響，本實驗中混合液中醇類加量均為5%，混合液含量為濃縮液的10倍體積，按照2.2所述實驗方法進(jìn)行結(jié)晶實驗。實驗結(jié)果見表1：

由表中實驗數(shù)據(jù)可以看出，ECBN在低級醇-丙酮體系中結(jié)晶有很明顯的純化效果，其中在乙醇/丙酮和甲醇/丙酮體系中，所得干粉的色譜純度和含量均有大幅度的提高，異丙醇/丙酮混合液純化效果較差，所選三種醇類/丙酮混合液對收率的影響并不明顯，甲醇/丙酮體系收率略低，乙醇/丙酮混合液純化效果最好，為最佳純化體系，以下實驗都是在此體系下完成。

3.2 混合液中乙醇含量對純化效果和收率的影響

乙醇/丙酮體系中乙醇含量是純化效果和收率的關(guān)鍵影響因素，逐漸增加混合液中乙醇含量，乙醇含量從1%～7%逐次增加，研究其對純化效果的影響，用液相檢測其色譜純度和含量，并計算純化收率，本次實驗混合液用量為濃縮液體積的10倍體積。

表1 混合液成分對純化效果的影響

圖2 混合液中乙醇含量對色譜純度的影響

圖3 混合液中乙醇含量對含量的影響

隨著混合液中乙醇含量的增加，結(jié)晶后的ECBN色譜純度迅速增加，上升趨勢明顯，所選ECBN濃縮液在純丙酮中結(jié)晶得到的干粉色譜純度僅為88.76%，當(dāng)混合液中乙醇含量為5%時，純化效果已極為明顯，色譜純度高達(dá)93.68%，當(dāng)乙醇含量增加至7%時，色譜純度可達(dá)94.05%。

與色譜純度類似，隨著混合液中乙醇含量的增加，見圖3，結(jié)晶后的ECBN含量迅速增加，所選ECBN濃縮液在純丙酮中結(jié)晶得到的干粉含量僅為66.30%，當(dāng)混合液中乙醇含量為5%時，含量大幅提高至76.88%，當(dāng)乙醇含量增加至7%時，含量可達(dá)77.46%。

根據(jù)干粉含量計算結(jié)晶步驟的收率，從而確定乙醇在混合液中較優(yōu)的含量，圖4為混合液中乙醇含量收率的影響，圖中可以看到隨著混合液中乙醇含量的增加，結(jié)晶收率不斷下降，這是因為隨著混合液中乙醇含量的不斷增加，ECBN在體系中溶解度也會逐漸提高。當(dāng)混合液中乙醇含量大于6%時，收率下降較為明顯，當(dāng)乙醇含量大于7%時，收率僅為88.1%，考慮到混合液中乙醇含量大于時5%，所得干粉含量和色譜純度增加幅度較小，可認(rèn)為混合液中乙醇含量5%～6%為最佳純化含量，此時所得干粉的純化效果極好，收率較高。

3.3 混合液用量對純化效果的影響

本步驟考察了混合液用量對色譜純度的影響，實驗中用濃縮液體積作為基準(zhǔn)，混合液用量用濃縮液體積倍數(shù)計量，混合液用量在濃縮液體積的2～14倍范圍內(nèi)進(jìn)行選擇，用液相考察純化效果和收率，本次實驗中混合液為乙醇/丙酮體系，乙醇含量為5%。

圖4 混合液中乙醇含量對收率的影響

本實驗中發(fā)現(xiàn)混合液用量的增加只是略微降低了所得ECBN干粉的的色譜純度，對純化效果的影響并不太明顯，見圖5，當(dāng)混合液的用量為濃縮液的2倍體積時，所得干粉的色譜純度為94.89%，當(dāng)混合液用量為濃縮液體積的14倍體積時，干粉色譜純度93.22%，色譜純度下降幅度并不大。

如圖6所示，隨著混液用量的增加，純化收率迅速升高，當(dāng)混合液用量為濃縮液8倍體積時，純化收率就可達(dá)91.6%，綜合考慮混合液用量對色譜純度的影響有限，可以確定混合液的最佳用量為濃縮液的10～12倍體積。

圖5 混合液用量對色譜純度的影響

圖6 混合液用量對收率的影響

圖7 棘白霉素B母核液相圖

4 小結(jié)

本實驗制備制出ECBN無定形干粉，與晶體相比無定形狀態(tài)的表面自由能更高，在水中溶解速率更高[6,7]，有利于之后相關(guān)純化步驟的進(jìn)行。

本實驗確定了ECBN最佳的結(jié)晶條件，在乙醇/丙酮體系中對棘白霉素B母核進(jìn)行結(jié)晶純化，可制備出較高純度的ECBN不定形干粉，在此體系中，當(dāng)乙醇含量為5%混合液用量為10BV時，可以純化出色譜純度高達(dá)93.68%，含量高達(dá)76.88%干粉(圖7)，本方法對ECBN的純化效果極為明顯，并且有較高的收率，可達(dá)90%以上。