尹春麗，騫 婧，王 軍，牛衛(wèi)寧*

1西安文理學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，西安 710065；2西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，西安 710072

胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase，CBS)是體內(nèi)催化合成氣體信號(hào)分子硫化氫(H2S)的三種酶之一[1，2]，硫化氫在哺乳動(dòng)物體內(nèi)參與多種生物學(xué)過程[3，4]。近期研究表明在結(jié)腸癌、卵巢癌和乳腺癌中CBS來源H2S濃度的升高促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[5-7]。通過RNA干擾或加入抑制劑降低CBS活性則抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖，減少了體內(nèi)腫瘤的生長[8，9]，這些發(fā)現(xiàn)表明CBS可能是一個(gè)潛在的抗腫瘤靶點(diǎn)。因此，研發(fā)高效的CBS選擇性抑制劑具有重要的意義。

氨基氧乙酸(AOAA)是目前唯一被廣泛使用的CBS抑制劑。AOAA通過不可逆結(jié)合磷酸吡哆醛(pyridoxal 5′-phosphate，PLP)輔因子抑制酶活性，因此AOAA是PLP依賴酶的廣譜性抑制劑[10]。另外，在生理?xiàng)l件下抑制CBS活性需要高濃度的AOAA(1～10 mmol/L)，因此AOAA作為CBS抑制劑存在選擇性差和抑制作用弱的不足[11]。在作者實(shí)驗(yàn)室前期研究中，通過高通量篩選天然產(chǎn)物化合物文庫獲得幾個(gè)CBS選擇性抑制劑，其中來源于中草藥貫葉連翹(HypericumperforatumL.)的化合物金絲桃素(hypericin)對(duì)CBS活性具有強(qiáng)的抑制作用[12]。金絲桃素是一種天然的光敏劑，經(jīng)光激活產(chǎn)生單線態(tài)氧可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制其生長，同時(shí)金絲桃素對(duì)腫瘤組織具有特異的親和力，也被廣泛用于腫瘤的光動(dòng)力學(xué)診斷中[13-15]。然而，金絲桃素作為CBS抑制劑的抗腫瘤活性并不清楚。本論文研究了金絲桃素作為CBS抑制劑的體內(nèi)外抗結(jié)腸癌活性。

1 材料與儀器

1.1 材料

金絲桃素(純度≥98%)購自成都曼斯特生物科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO)、同型半胱氨酸、氨基氧乙酸(AOAA)和炔丙基甘氨酸(PAG)購自美國Sigma公司；CCK-8細(xì)胞活性檢測試劑盒購自日本Dojindo公司；CBS抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29購自美國典型菌種保藏中心(ATCC)；親和層析柱GSTrap FF和HisTrap FF 購自美國GE公司；其他所有試劑均為分析純。

1.2 儀器

多功能酶標(biāo)儀(SynergyTMH1,Biotek,美國)；蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Bio-rad，美國)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(TanonTM5200，北京原平皓生物技術(shù)有限公司，中國)；超聲波細(xì)胞破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司，中國)；恒溫震蕩搖床(上海智城分析儀器制造有限公司，中國)；大容量高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司，中國)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo,美國)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 人胱硫醚-β-合成酶(CBS)和人胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)的表達(dá)純化

人CBS的表達(dá)純化根據(jù)作者以前發(fā)表的文獻(xiàn)進(jìn)行[1,12]。重組大腸桿菌發(fā)酵液(6 L)經(jīng)離心后得到菌體，然后將菌體重懸于500 mL 裂解液中(50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，pH7.4)并使用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎。隨后，在4 ℃下 12 000 rpm離心30 min獲得上清液，上清液過預(yù)先平衡的GSTrap FF親和層析柱，然后使用平衡緩沖液(50 mM Tris-HCl,pH8.0)洗脫除去雜蛋白。在層析柱中加入凝血酶(5 U/mg重組蛋白)4 ℃柱上酶切16 h，收集CBS蛋白儲(chǔ)存于-80 ℃?zhèn)溆?。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測結(jié)果表明重組CBS純度大于90%。人胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)的表達(dá)純化參照作者發(fā)表的文獻(xiàn)進(jìn)行[12]。

2.2 硫化氫(H2S)含量測定

使用亞甲藍(lán)法測定反應(yīng)液中H2S的含量[11]。當(dāng)測定CBS重組蛋白催化合成H2S的實(shí)驗(yàn)時(shí)，反應(yīng)液(200 μL)包含 50 mmol/L HEPES 緩沖液 (pH7.4)、 0.4 mmol/L Pb(NO3)2、 2 mmol/L 同型半胱氨酸和 5 μg CBS 蛋白。當(dāng)測定HT29細(xì)胞裂解液催化產(chǎn)生H2S的實(shí)驗(yàn)時(shí)，使用冰冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌培養(yǎng)的HT29細(xì)胞3次，然后將收獲的細(xì)胞在液氮/水浴中凍融5次破碎，反應(yīng)液200 μL包含180 μL細(xì)胞裂解液和2 mmol/L 同型半胱氨酸。在反應(yīng)液中加入2 mmol/L半胱氨酸底物開始反應(yīng)，在37 ℃孵育30 min后加入25 μL 20 mmol/L的N,N-二甲基-1,4-苯二胺(溶解于7.2 mol/L HCl)和25 μL 30 mmol/L的FeCl3(溶解于1.2 mol/L HCl)終止反應(yīng)。孵育15 min后反應(yīng)液在12 000 rpm離心10 min獲得上清液。轉(zhuǎn)移上清液至96孔板中，在670 nm波長下測量吸光度。使用標(biāo)準(zhǔn)濃度的Na2S溶液制作H2S濃度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中H2S濃度。

2.3 金絲桃素對(duì)CBS活性的影響

使用亞甲藍(lán)法測定不同劑量金絲桃素對(duì)CBS活性的影響，金絲桃素抑制CBS活性的半抑制濃度(IC50)被測定，反應(yīng)混合物總體積為200 μL，包括2 mmol/L 半胱氨酸、2 mmol/L 同型半胱氨酸、5 μg CBS、 0.4 mmol/L Pb(NO3)2和體積分?jǐn)?shù)為5%的DMSO。以未加金絲桃素的反應(yīng)混合物作為對(duì)照。

2.4 小干擾RNA(siRNA)介導(dǎo)的CBS基因沉默

為了研究哺乳動(dòng)物細(xì)胞中CBS蛋白是否是金絲桃素作用的靶標(biāo)，通過RNA干擾技術(shù)抑制CBS基因的表達(dá)，siRNA的序列如下所示。5′-GGAAGAAGUUCGGCCUGAATT-3′，5′-GGAACUACA UGACCAAGUUTT-3′和5′-CCAUUGACUUGCUGAA CUUTT-3′，隨機(jī)的siRNA被作為陰性對(duì)照。所有siRNA序列的設(shè)計(jì)和合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。當(dāng)HT29細(xì)胞生長到30%～40%融合度時(shí)，使用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在37 °C繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

2.5 細(xì)胞活力檢測

HT29細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基(Life Technologies公司)中37 °C，φB=5% CO2進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基包含φB=10%的胎牛血清(Biological Industries公司)和青霉素-鏈霉素溶液(Sigma公司)。使用CCK-8細(xì)胞活性檢測試劑盒測定金絲桃素抑制HT29細(xì)胞增殖的IC50值。接種HT29細(xì)胞于96孔板中(每孔包含1×104個(gè)細(xì)胞)，培養(yǎng)24 h后更換含有不同濃度金絲桃素的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后加入CCK8溶液在37 °C孵育2 h，在450 nm測定吸收度。以不包含金絲桃素的樣品作為對(duì)照，計(jì)算不同濃度金絲桃素存在條件下的細(xì)胞存活率。

2.6 體內(nèi)抗腫瘤活性

BALB/c裸鼠購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)研究所，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由西北工業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行(批準(zhǔn)號(hào)：2018017)。將HT29 細(xì)胞(每毫升1×107個(gè)細(xì)胞，100 μL)皮下接種于5周齡雌性小鼠的右前肢腋窩。使用游標(biāo)卡尺每三天測定腫瘤的體積(腫瘤體積=0.5×長×寬2)，當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約100 mm3時(shí)，所有小鼠被隨機(jī)分成5組(每組6只)，分別為溶劑對(duì)照組(包含φB=5%的DMSO和ρB=5 g/L的羧甲基纖維素鈉溶解于PBS緩沖液中)、陽性藥物AOAA對(duì)照組(10 mg/kg·d)、金絲桃素低(5 mg/kg·d)、中(10 mg/kg·d)和高劑量組(30 mg/kg·d)，小鼠每周注射藥物6次，連續(xù)給藥2周。

2.7 Western blot法檢測細(xì)胞CBS蛋白表達(dá)水平

使用冰冷的PBS溶液洗滌細(xì)胞3次，然后加入裂解液(50 mmol/L Tris-HCl pH7.4,150 mmol/L NaCl,ρB=5 g/L的脫氧膽酸鈉,φB=1%的NP40和蛋白酶抑制劑)裂解細(xì)胞，在4 °C下12 000 rpm離心10 min獲得上清液，BCA法測定蛋白濃度并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，封閉。加入兔源CBS一抗(1∶1 000)4 °C過夜孵育，加二抗孵育2 h(1∶5 000),使用天能TanonTM化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行分析拍照，使用 Image J軟件分析Western-blot條帶灰度值進(jìn)行相對(duì)定量。

2.8 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism version 6.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 金絲桃素選擇性抑制CBS活性

作者實(shí)驗(yàn)室前期通過高通量篩選天然產(chǎn)物文庫獲得了幾種CBS抑制劑，其中金絲桃素(圖1A)對(duì)CBS活性的抑制作用最強(qiáng)[12]。本研究中使用亞甲藍(lán)方法測定不同濃度金絲桃素對(duì)CBS和CSE活性的影響，結(jié)果如圖1B所示。在底物2 mmol/L半胱氨酸和2 mmol/L同型半胱氨酸存在的條件下，金絲桃素抑制CBS活性的IC50為7.9 ± 1.42 μmol/L。另外，測定了AOAA(目前普遍使用的CBS抑制劑)對(duì)CBS產(chǎn)H2S活性的影響，結(jié)果如圖1C所示，IC50為8.2 ± 1.14 μmol/L，表明金絲桃素對(duì)CBS活性的抑制效果和AOAA基本一致。另外，為了評(píng)估金絲桃素抑制CBS的選擇性，分別測定了不同濃度金絲桃素對(duì)CSE(另一種H2S合成酶)活性的影響，結(jié)果表明金絲桃素對(duì)CSE僅有非常微弱的抑制活性，IC50為83.0 ± 16.68 μmol/L(圖1D)，以上結(jié)果表明金絲桃素對(duì)CBS活性的抑制具有較高的選擇性(相對(duì)于CSE)。

3.2 金絲桃素抑制HT29細(xì)胞的增殖

作者前期研究表明在HT29細(xì)胞中CBS蛋白存在高表達(dá)，而另一種H2S合成酶CSE表達(dá)量則非常低[16]。在本研究中使用亞甲藍(lán)法測定HT29細(xì)胞裂解液中CBS和CSE蛋白的產(chǎn)H2S活性，反應(yīng)液中加入PAG(普遍使用的CSE特異性抑制劑)或AOAA(CBS和CSE的抑制劑)。結(jié)果如圖2A所示，未加抑制劑的HT29細(xì)胞裂解液產(chǎn)H2S活性為36.6 ± 1.13 nmol/h·mg 蛋白，當(dāng)在細(xì)胞裂解液中加入2 mmol/L PAG或1 mmol/L AOAA后，H2S產(chǎn)生活性分別為33.1 ± 1.04 nmol/h·mg蛋白和6.3 ± 0.35 nmol/h·mg蛋白。因此，計(jì)算得知CSE來源的H2S產(chǎn)率為3.5 nmol/h·mg蛋白，CBS來源的H2S產(chǎn)率為26.8 nmol/h·mg蛋白，CBS來源H2S產(chǎn)率超過CSE來源H2S產(chǎn)率的8倍，以上結(jié)果表明CBS是HT29細(xì)胞中催化合成H2S的主要酶。另外，當(dāng)在細(xì)胞裂解液中加入0.5 mmol/L金絲桃素后，H2S產(chǎn)生活性為7.7 ± 0.62 nmol/h·mg蛋白，表明金絲桃素和AOAA均能顯著抑制細(xì)胞裂解液中CBS的產(chǎn)H2S活性。

圖1 金絲桃素和AOAA劑量依賴性地抑制CBS活性Fig.1 Dose-dependent inhibition of CBS activity by hypericin and AOAA注： A.金絲桃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)；B.不同濃度金絲桃素對(duì)CBS活性的抑制曲線及其IC50值；C.不同濃度AOAA對(duì)CBS活性的抑制曲線及其IC50值；D.不同濃度金絲桃素對(duì)CSE活性的抑制曲線及其IC50值。Note:A.Chemical structure of hypericin;B and C.Dose-response curves of hypericin and AOAA versus CBS activity;D.Dose-response curves of hypericin versus CSE activity.

Szabo等研究表明CBS蛋白的高表達(dá)在促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖過程中起關(guān)鍵作用[5]，因此本研究測定了金絲桃素和AOAA對(duì)HT29細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果如圖2B所示，金絲桃素抑制HT29細(xì)胞增殖的IC50值為22.2 ± 2.25 μmol/L。然而，目前普遍使用的CBS抑制劑AOAA對(duì)HT29細(xì)胞增殖的抑制作用非常微弱，其IC50值為152.5 ± 35.68 μmol/L。

圖2 金絲桃素和AOAA對(duì)HT29人結(jié)腸癌細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effects of hypericin and AOAA on the viability of HT29 human colon cancer cells注：A.不同抑制劑對(duì)HT29細(xì)胞裂解液催化合成H2S的影響；B.不同濃度金絲桃素對(duì)HT29細(xì)胞活力的影響；C.不同濃度AOAA對(duì)HT29細(xì)胞活力的影響。Note:A.The H2S-producing activities of CBS and CSE in the HT29 cell lysate were measured in the presence of PAG,AOAA or hypericin.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;B.Effect of hypericin on the viability of HT29 colon cancer cells;C.Effect of AOAA on the viability of HT29 colon cancer cells.

AOAA作為一種極性小分子，細(xì)胞膜透性可能較差，這可能是導(dǎo)致AOAA對(duì)HT29細(xì)胞增殖抑制作用較弱的原因。

3.3 細(xì)胞內(nèi)CBS可能是金絲桃素的靶標(biāo)之一

為了研究在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中CBS蛋白是否作為金絲桃素作用的潛在靶標(biāo)，利用siRNA干擾HT29細(xì)胞內(nèi)CBS蛋白的表達(dá)，結(jié)果如圖3A所示。Western blot結(jié)果表明與對(duì)照組相比siRNA干擾后細(xì)胞內(nèi)CBS蛋白表達(dá)量減少到44%。接下來測定了金絲桃素對(duì)siRNA干擾后HT29細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如圖3B所示。金絲桃素抑制細(xì)胞增殖的IC50為55.8 ± 5.30 μmol/L，是金絲桃素抑制未處理HT29細(xì)胞增殖IC50值的2.5倍。同時(shí)，AOAA抑制siRNA干擾后HT29細(xì)胞增殖的IC50值增加到304.5 ± 63.01 μmol/L(圖3C)。這些結(jié)果表明在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)CBS蛋白可能是金絲桃素的靶標(biāo)之一。

圖3 金絲桃素對(duì)siRNA干擾后HT29細(xì)胞活力的影響Fig.3 Effects of hypericin on the viability of HT29 cells with siRNA-mediated knockdown of CBS.注：A.使用陰性對(duì)照siRNA(NC siRNA)或CBS靶向的siRNA(CBS siRNA)轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞，細(xì)胞裂解液進(jìn)行western blot 分析，使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參；B.不同濃度金絲桃素對(duì)siRNA干擾HT29細(xì)胞活力的影響；C.不同濃度AOAA對(duì)siRNA干擾HT29細(xì)胞活力的影響。Note:A.HT29 cells were transfected with a negative control siRNA (NC siRNA) or a CBS targeted siRNA (CBS siRNA) for 48 h;then,cell lysates were used for immunoblotting analysis.Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as the loading control;B.The IC50 value of hypericin against HT29 cells after the siRNA mediated knockdown of CBS was determined using the CCK-8 assay;C.The IC50 value of AOAA against HT29 CBS knockdown cells.

3.4 金絲桃素體內(nèi)抗腫瘤活性

為了研究金絲桃素體內(nèi)抗腫瘤活性，本研究建立了人結(jié)腸癌裸鼠原位移植瘤模型。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約100 mm3時(shí)，注射高(30 mg/kg·d)、中(10 mg/kg·d)、低劑量(5 mg/kg·d)金絲桃素和AOAA(陽性藥物對(duì)照組)進(jìn)行2周給藥。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明和溶劑對(duì)照組相比AOAA處理組(10 mg/kg·d)的小鼠體重顯著性降低，說明目前普遍使用的CBS抑制劑AOAA對(duì)小鼠具有一定的毒副作用，但是各種劑量金絲桃素處理組(5～30 mg/kg·d)的小鼠體重與溶劑對(duì)照組相比均無顯著性變化(表1)。

表1 不同藥物處理對(duì)小鼠體重的影響

注：*P<0.05 表示和對(duì)照組相比，體重差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Note:Compared with control,*P< 0.05.

小鼠給藥2周后被處死，剝離瘤體并稱重。結(jié)果表明與溶劑對(duì)照組相比不同劑量的金絲桃素(5～30 mg/kg·d)與AOAA處理組均顯著地抑制了腫瘤的生長(圖4A-C)，并且金絲桃素劑量依賴性地抑制腫瘤的生長。相對(duì)于溶劑對(duì)照組30 mg/kg·d劑量的金絲桃素以及AOAA處理分別使腫瘤重量減少了68%和86%(圖4D)，表明金絲桃素和AOAA均具有顯著的抗結(jié)腸癌作用。然而，需要指出的是AOAA的體內(nèi)抗腫瘤活性可能并不完全歸因于其作為CBS的抑制劑。首先，CBS蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，AOAA必須透過細(xì)胞膜才能抑制CBS活性，繼而抑制腫瘤生長。然而本研究表明AOAA僅有非常弱的抑制HT29結(jié)腸癌細(xì)胞增殖活性，其IC50值為152.5 ± 35.68 μmol/L(圖2C)。其次，AOAA是PLP依賴酶的廣譜性抑制劑，對(duì)CBS的選擇性較差[10，11]，AOAA在體內(nèi)可能還有其它的靶標(biāo)。綜上所述，本研究結(jié)果表明金絲桃素在體內(nèi)外均具有顯著的抗結(jié)腸癌活性。

圖4 金絲桃素抑制人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤生長Fig.4 Hypericin inhibits tumor growth in human colon cancer xenograft models.注：A.不同給藥處理2周的腫瘤外觀(每組6只小鼠)；B.不同給藥處理腫瘤體積的變化情況；C.不同給藥處理2周腫瘤的體積；D.不同給藥處理2周腫瘤的重量。Note:A.The macroscopic appearance of tumors in BALB/c nude mice 14 days after treatment (n=6 per group);B and C.Hypericin treatment significantly reduced the tumor volume after the s.c.injection of HT29 cells in human tumor xenograft models.Each data point represents the mean ± SD (n=6);D.Mean tumor weight (±SD).*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001.

AOAA是目前唯一一種被廣泛使用的CBS抑制劑，但其存在抑制作用弱和選擇性差的不足，抑制HT29細(xì)胞增殖的IC50值高達(dá)152.5 ± 35.68 μmol/L。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)10 mg/kg·d劑量的AOAA對(duì)小鼠也具有一定的毒副作用，因此急需獲得高效的CBS選擇性抑制劑。金絲桃素是從金絲桃屬植物中分離得到的一種天然光敏劑[17]，被廣泛用于腫瘤的診斷和光動(dòng)力學(xué)治療研究中[18,19]，金絲桃素介導(dǎo)的光動(dòng)力學(xué)治療可以增強(qiáng)化療藥物順鉑對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用[20]。然而，金絲桃素作為硫化氫合成酶抑制劑的抗腫瘤活性未見報(bào)道。本研究結(jié)果表明金絲桃素作為CBS的選擇性抑制劑在體內(nèi)外均具有顯著的抗結(jié)腸癌活性。綜上所述，金絲桃素能作為CBS的選擇性抑制劑用于結(jié)腸癌的治療研究中。