王 琳，金桂芳，余河漢，李 巧，楊 紅

廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣州 510006

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種以認(rèn)知和記憶損害為特征的神經(jīng)退行性疾病，以細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)在腦內(nèi)異常沉積為主要病理特征[1]。Aβ在腦內(nèi)沉積會(huì)引起ROS過(guò)量產(chǎn)生，造成脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子過(guò)氧化，從而引起細(xì)胞和機(jī)體損傷，最終導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷[2,3]。在AD研究中，常使用Aβ片段如Aβ25-35及Aβ1-42在細(xì)胞上造AD模型進(jìn)行體外研究，該類模型具有與AD患者相似的生物學(xué)特性，如原纖維形成，誘導(dǎo)自由基生成，神經(jīng)毒性等[4]。自噬起到消除異常聚集蛋白和受損細(xì)胞器的關(guān)鍵作用，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)非常重要[5]。自噬功能會(huì)隨著年齡增長(zhǎng)而減退，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)毒性蛋白的異常聚集，從而增加AD發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，自噬誘導(dǎo)劑能通過(guò)激活自噬，減少線粒體ROS 釋放，減輕Aβ1-42誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞損傷，而自噬抑制劑會(huì)加劇Aβ1-42引起的細(xì)胞損傷[7,8]。

中藥遠(yuǎn)志具有安神益智的功效，常用于心腎不交導(dǎo)致的失眠多夢(mèng)、健忘驚悸，神志恍惚等癥。細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷是遠(yuǎn)志的主要活性成分，能夠顯著抑制Aβ25-35引起的PC12細(xì)胞凋亡和小鼠認(rèn)知功能障礙，并顯著改善海馬注射Aβ25-35后小鼠的認(rèn)知缺陷[9]。TEN化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，且其在腦脊液中的消除半衰期長(zhǎng)[10]，這些發(fā)現(xiàn)提示了TEN在臨床上防治AD的潛力。最近研究發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)志可通過(guò)誘導(dǎo)自噬減少Aβ的分泌起神經(jīng)保護(hù)作用[11]。因此，本研究討論TEN通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬，減少人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(SH-SY5Y)細(xì)胞Aβ25-35誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)，并探討TEN抑制Aβ25-35毒性的作用和機(jī)制，為T(mén)EN防治AD提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

TEN購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，純度為99.8%；Aβ25-35購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；MTT購(gòu)自廣州翔博生物科技有限公司；3-MA購(gòu)自美國(guó)Selleck Chemicals公司；ROS、SOD、過(guò)氧化氫酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；MDA、GSH-Px檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；引物由華大基因設(shè)計(jì)；PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)、SYBR?Premix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus)購(gòu)自日本TaKaRa公司；Rabbit anti-β-actin、Goat anti-Rabbit二抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Rabbit anti-Beclin-1、Rabbit anti-LC3、Rabbit anti-mTOR、Rabbit anti-AMPK、Rabbit anti-ULK1(Abcam公司)。

1.2 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)

SH-SY5Y細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞活力

SH-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，以5×103個(gè)/孔隨機(jī)接種于96孔板中，每組5個(gè)復(fù)孔。分組如下：Control;Aβ25-35(20 μmol/L);TEN(50 μmol/L);3-MA(10 mmol/L);Aβ25-35(20 μmol/L)+ TEN(50 μmol/L);3-MA(10 mmol/L)+ Aβ25-35(20 μmol/L);3-MA(10 mmol/L)+ TEN(50 μmol/L)+ Aβ25-35(20 μmol/L)。先加入TEN或3-MA預(yù)處理2 h，再加入Aβ25-35共同處理24 h。每孔加入5 mg/mL 的MTT試劑10 μL，37 ℃孵育4 h后避光吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入DMSO 150 μL，于搖床上低速震搖10 min，充分溶解結(jié)晶，用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，細(xì)胞存活率%=(A實(shí)驗(yàn)組-A調(diào)零組)/(A對(duì)照組-A調(diào)零組)×100%。

1.4 觀察細(xì)胞形態(tài)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，以3×104個(gè)/孔接種于6孔板中。分組如1.3。37 ℃孵育24 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.5 DCFH-DA 熒光探針檢測(cè)ROS水平

SH-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期,以3×104個(gè)/孔接種于6孔板中。分組如下：Control;Aβ25-35(20 μmol/L);Aβ25-35(20 μmol/L)+ TEN (50 μmol/L);3-MA(10 mmol/L)+ TEN (50 μmol/L) + Aβ25-35(20 μmol/L)。先加入TEN和3-MA預(yù)處理2 h，再加入Aβ25-35共同處理24 h。收集細(xì)胞，將細(xì)胞重懸吸至1.5 mL EP管中，每管加入10 μM的DCFH-DA 200 μL，37 ℃孵育30 min。每隔3～5min顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。使用熒光酶標(biāo)儀對(duì)各組細(xì)胞熒光值進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 試劑盒檢測(cè)MDA、SOD、GSH-Px和過(guò)氧化氫酶(CAT)含量

按1.5培養(yǎng)細(xì)胞，收集細(xì)胞上清液及裂解液，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，測(cè)定SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD、GSH-Px和過(guò)氧化氫酶含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 RT-qPCR分析

按1.5培養(yǎng)細(xì)胞，用Trizol提取細(xì)胞總RNA，并用微量紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)OD260/280值及RNA濃度。按照TaKaRa的PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將得到的cDNA按TaKaRa的SYBR?Premix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus)試劑盒說(shuō)明書(shū)用CFX96Real-Time PCR Detection System進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.8 Western blot 分析

按1.5培養(yǎng)細(xì)胞，用含有PMSF的RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，以12 000 g、4 ℃離心5 min，BCA法測(cè)定蛋濃度。根據(jù)蛋白分子量，配制12%和6%的分離膠及5%的濃縮膠，設(shè)置80 V、30 min和120 V、60 min進(jìn)行SDS-PAGE電泳，設(shè)置200 mA、90 min進(jìn)行濕轉(zhuǎn)，5%脫脂奶粉封閉，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h。TBST洗膜后用ECL 顯色液激發(fā)化學(xué)發(fā)光，曝光，β-actin 作為內(nèi)參。應(yīng)用Image J 軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度值比較。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 21.0進(jìn)行分析，當(dāng)P<0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以mean±SD的方式表示，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 TEN對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞活力的影響

如Fig.1所示，MTT結(jié)果顯示，Aβ25-35組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.01)，TEN組細(xì)胞活力基本無(wú)變化，3-MA組細(xì)胞活力下降，但與對(duì)照組比無(wú)顯著性差異，TEN+ Aβ25-35組細(xì)胞活力顯著高于Aβ25-35組，含有3-MA的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力都顯著下降(P<0.05)。結(jié)果表明，TEN對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞活力損傷具有保護(hù)作用，其作用可被3-MA抑制。

2.2 TEN對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)的影響

如Fig.2 所示，Control組細(xì)胞密度大，貼壁能力強(qiáng)，生長(zhǎng)狀態(tài)好(圖2A)，Aβ25-35組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，貼壁性變差，折光性減弱，形態(tài)變差(圖2B)。TEN組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)好(圖2C)，3-MA組細(xì)胞胞體出現(xiàn)明顯皺縮，胞體邊緣模糊(圖2D)，Aβ25-35+TEN組細(xì)胞折光性變強(qiáng)，細(xì)胞狀態(tài)良好(圖2E)，Aβ25-35+3-MA組細(xì)胞出現(xiàn)明顯聚集狀態(tài)，折光性變差(圖2F)，TEN+3-MA+Aβ25-35組，細(xì)胞數(shù)比TEN+Aβ25-35組少，但細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)基本正常(圖2G)。結(jié)果表明，TEN能改善Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)損傷，其作用可被3-MA抑制。

圖1 Aβ25-35和TEN對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響Fig.1 The effects of Aβ25-35 and TEN on the viability of the SH-SY5Y cells注：與正常組相比，**P<0.01；與Aβ25-35組比較，## P < 0.01，#P< 0.05。Notes:**P<0.01 vs control;#P< 0.05 vs Aβ25-35 ;##P<0.01 vs Aβ25-35．

2.3 TEN對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響

如Fig.3所示，Aβ25-35組SH-SY5Y細(xì)胞的ROS、MDA水平顯著增加(P<0.05，P<0.01)，而SOD、GSH-Px和過(guò)氧化氫酶的活性顯著降低(P<0.05，P<0.01)；與Aβ25-35組相比，TEN能顯著減少ROS、MDA的產(chǎn)生而增加GSH-Px和CAT酶的活性(P<0.05，P<0.01)，同時(shí)3-MA會(huì)拮抗TEN的作用。結(jié)果表明，TEN顯著提高Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，其作用部分可被3-MA拮抗。

2.4 TEN對(duì)自噬標(biāo)志蛋白Beclin-1和LC3表達(dá)水平的影響

如Fig.4A RT-PCR結(jié)果顯示，Aβ25-35顯著增加Beclin-1(P<0.01)和LC3(P<0.05)的mRNA水平，與Aβ25-35組相比，TEN進(jìn)一步增加了Beclin-1和LC3 mRNA的表達(dá)(P<0.05)，而3-MA減少TEN誘導(dǎo)的Beclin-1和LC3 mRNA的表達(dá)。Fig.4BC Western blot結(jié)果顯示，Aβ25-35顯著增加了Beclin-1 蛋白表達(dá)水平(P<0.01)，但對(duì)LC3-II/I 蛋白表達(dá)水平影響沒(méi)有顯著性差異，與Aβ25-35組相比，TEN進(jìn)一步增加了Beclin-1和LC3-II/I 蛋白表達(dá)水平(P<0.01)，而3-MA減少TEN誘導(dǎo)的Beclin-1和LC3-II/I 蛋白表達(dá)。以上結(jié)果表明Aβ25-35誘導(dǎo)增加SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)自噬的發(fā)生，而TEN作用進(jìn)一步增加自噬的發(fā)生。

圖2 Aβ25-35和TEN對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的形態(tài)學(xué)的影響(×200)Fig.2 Morphological changes of SH- SY5Y cells by Aβ25-35 and TEN treatment (×200)

圖3 TEN對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響Fig.3 The effects of TEN on the oxidative stress induced by Aβ25-35注：與正常組相比，**P<0.01，*P<0.05；與Aβ25-35組比較，## P < 0.01，#P< 0.05。Notes:*P <0.05 vs control;**P <0.01 vs control;#P< 0.05 vs Aβ25-35;## P <0.01 vs Aβ25-35．

2.5 TEN對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞中的mTOR、AMPK和ULK1表達(dá)水平的影響

如Fig 5.A RT-PCR結(jié)果顯示，Aβ25-35顯著增加了mTOR mRNA表達(dá)水平(P<0.01)，并顯著降低了AMPK和ULK1 mRNA水平(P<0.01)，與Aβ25-35組相比，TEN顯著降低了mTOR mRNA表達(dá)水平(P<0.01)，并顯著升高了AMPK和ULK1 mRNA水平(P<0.01)，而3-MA增加TEN誘導(dǎo)的mTOR和ULK1 mRNA的表達(dá)，減少TEN誘導(dǎo)的AMPK mRNA的表達(dá)。圖5.BC Western blot結(jié)果顯示，Aβ25-35顯著增加了mTOR蛋白表達(dá)水平(P<0.01)，并顯著降低了AMPK和ULK1蛋白表達(dá)水平(P<0.01)，與Aβ25-35組相比，TEN顯著降低了mTOR蛋白表達(dá)水平(P<0.01)，并顯著升高了AMPK和ULK1蛋白表達(dá)水平(P<0.01)，而3-MA增加TEN誘導(dǎo)的mTOR和ULK1 蛋白表達(dá)，減少TEN誘導(dǎo)的AMPK mRNA的蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，TEN可能通過(guò)調(diào)控AMPK/mTOR/ULK1通路激活細(xì)胞自噬，起到神經(jīng)保護(hù)作用。

3 結(jié)論

AD 是常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，其病理特征主要包括腦內(nèi)Aβ異常沉積，Tau蛋白過(guò)度磷酸化所致神經(jīng)元纖維纏結(jié)，神經(jīng)元死亡等[1]。Aβ25-35是Aβ的毒性片段，可導(dǎo)致神經(jīng)元纖維形成，誘導(dǎo)自由基生成，產(chǎn)生神經(jīng)毒性等[12]，廣泛用于AD動(dòng)物模型和細(xì)胞模型的建立。遠(yuǎn)志是中草藥中記載的藥用植物，長(zhǎng)期用于治療記憶喪失和改善認(rèn)知功能[13]。TEN是一種提取自遠(yuǎn)志的活性成分，其極易進(jìn)入大腦并顯著改善老年小鼠的記憶和學(xué)習(xí)能力[9,10]，此外，TEN被證明可以保護(hù)PC12細(xì)胞免受Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[9]。通過(guò)建立Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞模型，我們發(fā)現(xiàn)TEN可以改善Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)變異和活力下降，而自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)能拮抗TEN的作用。

圖4 TEN對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的SY5Y細(xì)胞中LC3-Ⅱ和Beclin-1表達(dá)的影響 RT-PCR(A)，Western blot(B)和定量分析(C)Fig.4 Effects of TEN on expression of LC3-Ⅱ and Beclin-1 in SY5Y cells induced by Aβ25-35 detected by RT-PCR(A),Western blot(B) and confocal microscope(C)注：與正常組相比，**P<0.01，*P<0.05；與Aβ25-35組比較，## P < 0.01，#P< 0.05。Notes:*P <0.05 vs control;**P <0.01 vs control;#P< 0.05 vs Aβ25-35;## P <0.01 vs Aβ25-35．

圖5 TEN對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞中mTOR，AMPK和ULK1表達(dá)的影響 RT-PCR(A)，Western blot(B)和定量分析(C)Fig.5 Effects of TEN co-treatment on expression of mTOR,AMPK and ULK1 in SY5Y cells induced by Aβ25-35detected by RT-PCR(A),Western blot(B)and confocal microscope(C)注：與正常組相比，**P<0.01，*P<0.05；與Aβ25-35組比較，## P < 0.01，#P< 0.05。Notes:*P <0.05 vs control;**P <0.01 vs control; #P< 0.05 vs Aβ25-35;## P <0.01 vs Aβ25-35．

氧化還原平衡是細(xì)胞生存的必要條件[14]。Aβ在腦內(nèi)沉積能引起氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激也能反過(guò)來(lái)促進(jìn)Aβ在腦內(nèi)的聚集，導(dǎo)致DNA受損、線粒體功能紊亂、膜穩(wěn)定性降低和細(xì)胞凋亡等神經(jīng)毒性，進(jìn)一步加快AD發(fā)展[15]。Song Y 等[8]發(fā)現(xiàn)雷帕霉素通過(guò)上調(diào)自噬，增強(qiáng)PC12細(xì)胞對(duì)損傷線粒體的清除能力，繼而減少了H2O2誘導(dǎo)的ROS釋放，降低細(xì)胞死亡率。相反，3-MA下調(diào)自噬，抑制線粒體自噬過(guò)程，導(dǎo)致?lián)p傷線粒體在細(xì)胞中累積，并釋放大量ROS進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，提示激活自噬能拮抗氧化應(yīng)激損傷。張晶等[16]發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)志皂苷元能減少H2O2模型鼠海馬神經(jīng)元的MDA含量，升高SOD活性，從而提高海馬神經(jīng)元的抗氧化能力。本研究結(jié)果表明，TEN能減輕Aβ25-35對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的氧化應(yīng)激作用，其作用可被而3-MA逆轉(zhuǎn)。

細(xì)胞通過(guò)自噬-溶酶體降解機(jī)制，對(duì)異常蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器進(jìn)行分解，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，增強(qiáng)細(xì)胞的活力[17]。Beclin-1是調(diào)節(jié)自噬體起始物質(zhì)組裝的分子平臺(tái)，其激活可以上調(diào)自噬。有研究表明，Beclin-1基因敲除的小鼠會(huì)因缺乏自噬活性而導(dǎo)致神經(jīng)退行病變[18]。此外，當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，LC3-I 會(huì)脂化為L(zhǎng)C3-II定位于自噬體上，因此LC3-II/I常作為自噬的標(biāo)志性蛋白來(lái)檢測(cè)自噬水平。研究發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)志能通過(guò)mTOR/AMPK通路加速異常蛋白的清除以及減少APP/BACE1細(xì)胞中Aβ的產(chǎn)生[19]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶酶(mammalian target of rapamycin,mTOR) 是一種蛋白激酶，是自噬的負(fù)調(diào)控因子，對(duì)維持神經(jīng)細(xì)胞正常功能起重要作用。腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate AMP-activated protein kinase,AMPK) 可在細(xì)胞內(nèi)缺乏能量時(shí)被激活，被活化的AMPK 會(huì)抑制 mTOR，從而促進(jìn)自噬體形成。ULK1是Atg1的同源物，激活mTOR能夠抑制ULK1活性而抑制自噬，而AMPK能誘導(dǎo)ULK1的磷酸化而激活自噬[19]。本研究結(jié)果顯示，TEN增加Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Beclin-1和LC3-II/I水平，其激活細(xì)胞自噬的過(guò)程可能與mTOR/AMPK/ULK1信號(hào)通路有關(guān)。

總之，我們的研究結(jié)果表明TEN可通過(guò)調(diào)控mTOR/AMPK/ULK1通路增強(qiáng)細(xì)胞自噬，降低Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，增強(qiáng)細(xì)胞活力和改善細(xì)胞形態(tài)，發(fā)揮抑制毒性的神經(jīng)保護(hù)作用。調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬是治療AD的潛在策略之一，而TEN 可能是一種涉及到多機(jī)制的藥物，其調(diào)控細(xì)胞自噬機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。