彭小芝，馬朝芝，夏 雨，涂儀軍，尤朋濤,2，劉焱文,2*

1湖北中醫(yī)藥大學藥學院；2湖北中醫(yī)藥大學 中藥資源與中藥化學湖北省重點實驗室，武漢 430065

哮喘(asthma)是一種由多種細胞組分及復雜細胞因子參與的對過敏性與非過敏性因素做出特異性反應的一種慢性氣道炎癥性疾病，其中IL-4、IL-17A和IFN-γ是參與調(diào)節(jié)哮喘氣道炎癥反應的重要細胞因子，這些細胞因子由輔助性T細胞(thelper cell，Th)分泌并調(diào)節(jié)炎癥反應發(fā)展[1-3]。研究表明，許多炎癥介質(zhì)的合成和釋放都依賴于絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的激活，MAPK通路參與了炎癥因子產(chǎn)生、分化、凋亡等生理病理過程，阻斷其級聯(lián)反應，可減輕炎癥癥狀[4,5]。因此，哮喘防治的關(guān)鍵在于對哮喘發(fā)病各環(huán)節(jié)分子機制的深入研究，從而從病因?qū)W、基因水平研制出針對哮喘的靶向治療藥物。

一直以來，支氣管擴張藥和皮質(zhì)激素類藥物是治療哮喘的主要藥物，但由于其長期服用易產(chǎn)生耐受性或不良反應，所以臨床應用受到了一定的限制。因此，積極尋找更加安全有效的抗哮喘藥物具有重要的實際意義。據(jù)《新華本草綱要》介紹，毛喉鞘蕊花味辛、性涼，具有散寒解表、祛痰止咳的功能，有降壓、止痛、擴呼吸系統(tǒng)疾患[6-8]。課題組前期發(fā)現(xiàn)， CFE對呼吸道疾病具有良好的防治作用，對卵清蛋白致豚鼠擴張支氣管、擴張血管和強心作用，可用于治療感冒消炎、肺結(jié)核等哮喘有一定治療作用[9]。本實驗在此基礎(chǔ)上，以大鼠作為研究對象，采用OVA誘導大鼠的哮喘模型，觀察不同給藥劑量CFE 對大鼠哮喘癥狀的改善情況，通過檢測過敏性哮喘模型大鼠血清和BALF中IFN-γ、IL-4和IL-17A的含量水平，比較肺組織p-ERK、p-JNK和 p-p38的表達水平，檢測CFE調(diào)控 MAPK信號通路上相關(guān)蛋白的表達，探討其抑制哮喘炎癥的作用機制，為過敏性哮喘的臨床治療提供依據(jù)，為相關(guān)基礎(chǔ)和臨床研究提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠60只，體重160～180 g，雄性，購自湖北省疾病預防控制中心，動物質(zhì)量合格證編號：SCXK(鄂)2015-0018。

1.2 材料與試劑

毛喉鞘蕊花(采摘于湖北省通城，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學生藥教研室吳和珍教授鑒定為唇形科鞘蕊屬植物毛喉鞘蕊花正品)；卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)(美國Sigma公司)；阿拉伯膠(上海麥克林生化科技有限公司)；地塞米松(天津天藥藥液股份有限公司)；氫氧化鋁(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；HE染液(碧云天生物技術(shù)有限公司)；IL-4、IL-17A、IFN-γ ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)；MAPK抗體試劑盒(美國Cell Signaling Technology公司)；ECL試劑盒(美國Bio-Rad公司)。

1.3 主要儀器

XR-YLS-8A多功能誘咳引喘儀(上海欣軟信息科技有限公司)；多功能酶標儀(瑞士Tecan公司)；凝膠電泳電轉(zhuǎn)儀(美國Bio-Rad公司)；正置光學顯微鏡(日本Nikon Eclipse E100)；成像系統(tǒng)(日本Nikon DS-U3)。

2 方法

2.1 毛喉鞘蕊花提取物制備

將毛喉鞘蕊花藥材打碎成粗粉，置于滲漉桶內(nèi)，用70%的乙醇浸泡過夜，次日以2 mL/min左右的速度開始進行滲漉，收集到的濾液進行減壓濃縮，最終置于水浴鍋上濃縮，得到浸膏(每克含4.24 g生藥)。置冰箱中保存?zhèn)溆茫脮r將浸膏取出，置40～50 ℃的水浴中輕輕振搖均勻，稱取適量的浸膏，用1%阿拉伯膠配制成相應濃度混懸液混勻備用，供實驗動物灌胃使用。

2.2 動物模型建立

60只SD大鼠，隨機分為5組，每組各12只，即空白組、模型組、地塞米松組、CFE高劑量組、CFE低劑量組。實驗第1天和第8天向每只(除空白組)大鼠腹腔及皮下注射新鮮配制的OVA混懸液(100 mg OVA + 100 mg AL(OH)3生理鹽水混懸)1 mL致敏，空白組給予同等劑量生理鹽水。第15 天將各組大鼠置于霧化儀中，除空白組以生理鹽水氣霧攻擊外，其余各組均噴入1%OVA生理鹽水溶液霧化，自然吸入以誘發(fā)哮喘，每天1次，每次30 min，連續(xù)14天，以呼吸急促深快，煩躁嗆咳，四肢搔抓，點頭運動及糞便增多等癥狀的出現(xiàn)為激發(fā)成功。

2.3 給藥方法

于實驗第15天開始灌胃給藥(1 mL/100 g)，每次霧化吸入激發(fā)前1小時給予藥物干預，空白組與模型組給予生理鹽水，地塞米松組給予地塞米松2 mg/kg，CFE高劑量組、CFE低劑量組分別給予毛喉鞘蕊花提取物12.8、6.4 g/kg，每天1次，連續(xù)給藥14天。

2.4 標本收集和處理

各組大鼠均在末次激發(fā)后24 h內(nèi)取材。0.4%戊巴妥鈉腹腔麻醉(1 mL/100 g 體重)后采集標本。外周血血清采集：將大鼠麻醉，固定、剖腹，分離腹主動脈，取血，2 500 rpm，離心10 min，分離得血清，負80 ℃凍存待測。支氣管肺泡灌洗液(BALF)采集:將大鼠麻醉，分離出氣管及肺組織，結(jié)扎右肺，用大鼠灌胃針頭插入氣管并結(jié)扎，抽取3 mL生理鹽水對左肺進行灌洗，重復三次，將所得灌洗液收集于10 mL離心管，2 500 rpm，離心10 min，取上清分裝待測。

2.5 肺組織標本制備及病理學檢查

將大鼠麻醉，迅速打開胸腔,分離肺組織,取右肺組織,用4%甲醛固定24 h后常規(guī)石蠟包埋、切片。HE染色后,進行病理圖像分析。

2.6 ELISA法檢測血清和BALF中IL-4、IL-17A和IFN-γ含量

按ELISA試劑盒說明書進行操作，在終止反應后5 min內(nèi)，酶標儀于450 nm波長處檢測各孔吸光度，計算IL-4、IL-17A和IFN-γ含量。

2.7 Western blot法檢測肺組織p-ERK、p-JNK和p-p38MAPK蛋白表達

取部分肺組織，剪碎，滴加RIPA裂解液(含PMSF)，冷凍研磨成勻漿，冰上孵育30 min裂解，離心15 min，取上清液。BCA蛋白定量分析盒檢測蛋白濃度，上樣到SDS-PAGE膠，電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上(300 mA恒流，60 min)。轉(zhuǎn)膜完成后，5% BSA封閉液室溫封閉2 h，TBST洗滌10 min(3次)，分別使用p-ERK、p-JNK和p-p38(1∶1 000)及GAPDH (1∶10 000)一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌10 min (3次)，將NC膜與二抗(1∶2 000)室溫孵育1h，TBST洗滌10 min(3次)，ECL試劑盒化學發(fā)光法檢測蛋白條帶，曝光、顯影、定影后，凝膠圖像處理系統(tǒng)對蛋白條帶進行分析，計算目的蛋白相對表達。

2.8 統(tǒng)計學處理

3 結(jié)果

3.1 CFE改善OVA誘導的大鼠肺組織病理形態(tài)學變化

如圖1所示，空白組大鼠氣道上皮結(jié)構(gòu)完整，支氣管管壁光滑，上皮纖毛細胞排列整齊，管腔內(nèi)未見上皮細胞脫落，肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰完整;模型組大鼠氣道明顯狹窄，支氣管杯狀上皮細胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)不完整，纖毛細胞脫落明顯，固有層明顯增厚，黏膜層明顯增厚;與模型組相比，給藥組大鼠固有層增厚程度較輕，黏膜層增厚較模型組降低，其中地塞米松組大鼠支氣管結(jié)構(gòu)完整，管壁細胞排列紊亂，上皮細胞及杯狀細胞脫落減少，管徑正常；CFE高劑量組、CFE低劑量組支氣管黏膜上皮細胞及杯狀細胞增生減少，支氣管稍變形，管壁及平滑肌厚度明顯降低，以上變化均隨藥物劑量加大更顯著。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色Fig.1 HE staining results of lung tissue of rats in different groups注：A～E分別為空白組、模型組、CFE低劑量組、CFE高劑量組、地塞米松組。Notes:A-E were blank group,model group,low dose CFE group,high dose CFE group,Dexamethasone group.

3.2 CFE減輕OVA對大鼠血清和BALF中IL-4、IL-17A和IFN-γ含量的影響

如圖2所示，與模型組比較，地塞米松組和CFE高劑量組、CFE低劑量組IL-4、IL-17A含量均有不同程度降低(P<0.05，P<0.01)，IFN-γ含量升高(P<0.05)。在血清和BALF中，CFE高劑量組IL-4含量顯著降低(P<0.01)，含量接近于空白組，IL-17A含量明顯降低(P<0.05)，IFN-γ含量水平有顯著性差異(P<0.05);CFE低劑量組IL-17A、IFN-γ含量無顯著性差異。血清中地塞米松組IL-4、IL-17A含量明顯降低(P<0.05)，而在BALF中IL-4、IL-17A中含量變化無顯著性差異，IFN-γ在血清和BALF中含量明顯升高(P<0.05)。

圖2 各組大鼠血清和BALF中IL-4、IL-17A和IFN-γ含量Fig.2 The levels of IL-4，IL-17A and IFN-γ in serum and BALF in different groups注：A～E分別為空白組、模型組、CFE低劑量組、CFE高劑量組、地塞米松組；與模型組比較：*P<0.05，** P<0.01。Notes:A-E were blank group,model group,low dose CFE group,high dose CFE group,Dexamethasone group;Compared with the model group:*P<0.05,**P<0.01.

3.3 CFE調(diào)控OVA誘導大鼠中MAPK相關(guān)通路蛋白表達

如圖3所示，與模型組比較，地塞米松組和CFE高劑量組、CFE低劑量組p-ERK、p-JNK及p-p38MAPK蛋白表達均有不同程度的降低。CFE高低劑量組p-ERK蛋白表達均有顯著降低 (P<0.01)，CFE高劑量組p-JNK及p-p38MAPK蛋白表達均有顯著降低(P<0.05)，而CFE低劑量組p-JNK及p-p38MAPK蛋白表達無顯著性差異，地塞米松組p-ERK、p-JNK及p-p38MAPK蛋白表達有顯著降低(P<0.05)。

圖3 各組大鼠肺組織p-ERK、p-JNK及 p-p38蛋白表達Fig.3 The expressions of p-ERK、p-JNK and p-p38 proteins in lung tissues of different groups注：A～E分別為空白組、模型組、CFE低劑量組、CFE高劑量組、地塞米松組；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01。Notes:A-E were blank group,model group,low dose CFE group,high dose CFE group,Dexamethasone group;Compared with the model group:*P<0.05，**P<0.01.

4 結(jié)論

現(xiàn)有研究表明， 作為哮喘炎癥反應的調(diào)節(jié)器， Th1、Th2、Th17等Th淋巴細胞亞群主要通過分泌細胞因子來實現(xiàn)其功能[10]。Th17細胞可產(chǎn)生IL-17A， IL-17A是一種具有強大的招募中性粒細胞的前炎性細胞因子，與許多炎癥反應和自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。它能夠促進多種細胞釋放炎性因子，它可以促使氣道黏液腺分泌大量黏液，增加氣道的高反應性，從而在哮喘氣道重塑的過程中發(fā)揮重要的作用[11]，IL-4則是具有多種生物學效應的前炎性Th2細胞因子代表[12]，而IFN-γ是作為一種Th1 型細胞因子，具有強大的免疫調(diào)節(jié)作用，研究證實IFN-γ在胞內(nèi)細菌感染時有一定的保護作用，并參與自身免疫病的發(fā)生[13]。在過敏性哮喘中，IFN-γ與氣道單核細胞及中性粒細胞浸潤有關(guān)，并能抑制Th2細胞產(chǎn)生IL-4，對哮喘有一定的保護作用[14]。本研究顯示CFE高、低劑量組均能明顯上調(diào)大鼠血清和BALF中IFN-γ水平，下調(diào)IL-4和IL-17A水平，證實CFE可通過調(diào)節(jié)Th1細胞與Th2細胞之間的動態(tài)平衡，抑制血清和BALF中IL-17A以降低氣道高反應性，達到抗炎和調(diào)節(jié)免疫的作用，從而對過敏性哮喘起到治療作用。

MAPK信號通路是細胞中一條重要的分子通路，由多種同工酶組成，包括細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK) 和p38MAPK等。JNK通路和p38MAPK通路主要對炎性細胞因子和多種類型的細胞應激信號進行轉(zhuǎn)導，而ERK通路主要對細胞的生長、分裂和分化信號進行轉(zhuǎn)導，他們之間可以通過不同因素刺激激活，形成不同的轉(zhuǎn)導通路，激活不同的轉(zhuǎn)錄因子，介導不同的生物學效應，通路間可產(chǎn)生相互協(xié)同或抑制作用[15]。經(jīng)CFE干預治療后，大鼠肺組織p-ERK、p-JNK及p-p38 蛋白表達顯著下降，表明CFE能通過調(diào)控MAPK信號通路蛋白表達減輕哮喘氣道炎癥，延緩支氣管病理性損傷。

綜上所述，毛喉鞘蕊花提取物能抑制哮喘炎癥發(fā)生，其對哮喘炎癥反應的保護作用可能與下調(diào)機體的IL-4、IL-17A，上調(diào)IFN-γ等細胞因子和炎性反應介質(zhì)有關(guān)，其作用機制可能是通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達來干預炎癥發(fā)生發(fā)展，從而阻斷炎癥級聯(lián)反應，改善哮喘癥狀，發(fā)揮治療作用。