朱 淼，侯怡鈴，唐 賢，宋志強(qiáng)，丁 祥

1西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2西華師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，南充 637009

真菌多糖為天然的高分子化合物，對(duì)細(xì)胞的分裂分化及生長(zhǎng)衰老具有重要作用[1]，因其所具有的生物活性及藥理價(jià)值而成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)[2]。鵝膏菌屬(Amanita)是大型真菌中一個(gè)種類(lèi)繁多、分布廣泛的種屬，其多糖備受關(guān)注并已有廣泛的研究。Ruthes等[3]發(fā)現(xiàn)，毒蠅鵝膏多糖具有抗炎鎮(zhèn)痛的作用；Karaman等[4]研究發(fā)現(xiàn)，松果鵝膏多糖具有鎮(zhèn)痛作用，并能較好地清除OH-；Tang等[5]發(fā)現(xiàn)，黃蓋鵝膏多糖和豹斑毒鵝膏多糖能夠抑制人胃癌細(xì)胞(MGC)的生長(zhǎng)；祝雪嬌等[6]發(fā)現(xiàn)，紅黃鵝膏多糖具有抗腫瘤活性，能夠抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16)的生長(zhǎng)。以上研究均是對(duì)鵝膏菌屬中所含粗多糖的報(bào)道，但對(duì)其所含多糖的精細(xì)結(jié)構(gòu)并未表征，因此相關(guān)活性及其分子機(jī)制研究存在一定的不確定性。

橙蓋鵝膏(Amanitacaesarea)是鵝膏菌屬(Amanita)的一種食用真菌，菌蓋為橙色，也被稱(chēng)為“雞蛋菌”。在我們前期的研究中，從采摘于四川的橙蓋鵝膏子實(shí)體中提取了一種結(jié)構(gòu)新穎的多糖(AC-1)(圖1)，重均分子量Mw為19 329 Da。其精細(xì)結(jié)構(gòu)特征是以α-(1→4)-D-葡萄糖和α-(1→3)-D-葡萄糖為骨架，α-(1→3)-D-葡萄糖6-C上連接一個(gè)→1)-α-D-來(lái)蘇糖的側(cè)鏈，α-D-葡萄糖和α-D-來(lái)蘇糖的比例為2∶1[7]。然而，關(guān)于該橙蓋鵝膏多糖的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性的研究目前未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以橙蓋鵝膏多糖(AC-1)為研究對(duì)象，探究其對(duì)三種免疫細(xì)胞(T細(xì)胞、B細(xì)胞和RAW264.7)、小鼠成纖維細(xì)胞(L929)、小鼠胃癌細(xì)胞(MFC)和小鼠肉瘤細(xì)胞(S180)的影響。希望通過(guò)研究能夠進(jìn)一步明確橙蓋鵝膏多糖的體外免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞毒性和抗腫瘤活性，為開(kāi)發(fā)利用橙蓋鵝膏多糖資源提供一定的參考依據(jù)。

圖1 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of Amanita caesarea polysaccharide (AC-1)

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

橙蓋鵝膏菌(Amanitacaesarea)采自于四川省甘孜州，橙蓋鵝膏多糖(AC-1)參考文獻(xiàn)[7]的方法制備。T細(xì)胞、B細(xì)胞、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(RAW264.7)、小鼠成纖維細(xì)胞(L929)、小鼠胃癌細(xì)胞(MFC)和小鼠肉瘤細(xì)胞(S180)由中科院上海生命科學(xué)研究院生化與細(xì)胞所提供。

1.2 主要試劑和實(shí)驗(yàn)儀器

PRMI 1640培養(yǎng)基、雙抗、胰蛋白酶(Gibco)、脂多糖(LPS)購(gòu)于Sigma公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8試劑)購(gòu)于美國(guó)ZETA LIFE公司；中性紅試劑購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司；甘露聚糖肽(Mannatide)購(gòu)于成都利爾藥業(yè)有限公司；ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于R&D公司；無(wú)水乙醇購(gòu)于河南天冠集團(tuán)，乙酸購(gòu)于江蘇索普公司；3111型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo scientific)；Multiskan Go型酶標(biāo)儀(Thermo scientific)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對(duì)三種免疫細(xì)胞(T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞RAW264.7)增殖的影響

將細(xì)胞用培養(yǎng)液稀釋至1×105/mL，然后以每孔100 μL加入96孔板。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組，AC-1藥物組(設(shè)置1.25、2.5、5、10 μg/mL 共4個(gè)終濃度梯度)，LPS陽(yáng)性對(duì)照組(終濃度為5 μg/mL)，每個(gè)濃度6個(gè)重復(fù)。參照文獻(xiàn)[8]的方法檢測(cè)AC-1對(duì)三種免疫細(xì)胞的增殖效應(yīng)并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

增殖率(%)=[OD值(實(shí)驗(yàn)組)-OD值(空白

對(duì)照組)]/OD值(空白對(duì)照組)×100%

注：實(shí)驗(yàn)組為AC-1藥物組和LPS陽(yáng)性對(duì)照組。

1.3.2 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對(duì)B細(xì)胞分泌抗體的影響

本實(shí)驗(yàn)用ELISA試劑盒檢測(cè)AC-1刺激B細(xì)胞分泌的抗體Ig A、Ig M、Ig G和Ig E[9]。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組，AC-1藥物組(2.5、5、10 μg/mL)和LPS陽(yáng)性對(duì)照組(5 μg/mL)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值(OD值)，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.3 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的影響

取巨噬細(xì)胞RAW264.7用培養(yǎng)液稀釋至5×105/mL[10]，然后以每孔100 μL的劑量加入96孔板中，37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，依次加入100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液(空白對(duì)照)、終濃度為1.25、2.5、5、10 μg/mL的橙蓋鵝膏多糖(AC-1)溶液(AC-1藥物組)、終濃度為5 μg/mL的LPS溶液(陽(yáng)性對(duì)照組)，每組6個(gè)重復(fù)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸出上清，每孔中加入100 μL的0.075%的中性紅試劑，在培養(yǎng)箱中孵育15 min。15 min后，用PBS洗三次，然后每孔分別加入100 μL細(xì)胞裂解液(由無(wú)水乙醇和乙酸按1∶1的體積比配制而成)，培養(yǎng)箱中裂解2 h，利用酶標(biāo)儀在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.4 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞(L929)的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)參照1.3.1中AC-1對(duì)三種免疫細(xì)胞增殖影響的方法檢測(cè)AC-1對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞(L929)的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，AC-1藥物組設(shè)置5、10、15、20 μg/mL共4個(gè)終濃度梯度，其余步驟同1.3.1。

1.3.5 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對(duì)小鼠胃癌細(xì)胞(MFC)和小鼠肉瘤細(xì)胞(S180)的體外抑制

將配好的細(xì)胞懸液以每孔100 μL的劑量加入96孔板中培養(yǎng)24 h后，依次加入100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液(空白對(duì)照)、終濃度為5、10、15、20 μg/mL的AC-1溶液(AC-1藥物組)，終濃度為5 μg/mL的甘露聚糖肽(Man)溶液(陽(yáng)性對(duì)照組)后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，利用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

抑制率(%)=[OD值(空白對(duì)照組)-OD值

(實(shí)驗(yàn)組)]/OD值(空白對(duì)照組)×100%

注：實(shí)驗(yàn)組為AC-1藥物組和Man陽(yáng)性對(duì)照組。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用IBM SPSS Statistics 19軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異分析采取單因素方差分析，與空白對(duì)照組相比，P<0.05為差異性顯著，用“*”表示；P<0.01為差異性極顯著，用“**”表示。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)體外免疫調(diào)節(jié)活性

2.1.1 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響

T細(xì)胞是在胸腺分化成熟的一類(lèi)免疫細(xì)胞，它通過(guò)輔助激活B細(xì)胞以及產(chǎn)生細(xì)胞因子等方式參與機(jī)體免疫。AC-1對(duì)T細(xì)胞增殖的作用如圖2所示，AC-1的終濃度為1.25～10 μg/mL時(shí)，均能夠促進(jìn)T細(xì)胞的增殖(P<0.01)，且低中等濃度的AC-1對(duì)T細(xì)胞增殖效應(yīng)較好。細(xì)胞與藥物共培養(yǎng)24 h后T細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)如圖3所示，正常生長(zhǎng)的T細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)、成團(tuán)較小。在濃度為1.25～10 μg/mL時(shí)，T細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，數(shù)量增多，成團(tuán)變大。以上結(jié)果表明，AC-1可極顯著刺激T細(xì)胞的增殖及成團(tuán)，在機(jī)體的細(xì)胞免疫方面具有重要的作用。

圖2 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect on the proliferation of T cells by Amanita caesarea polysaccharide (AC-1)注：與空白對(duì)照組相比，P<0.05為差異性顯著，用“*”表示；P<0.01為差異性極顯著，用“**”表示。Note:Compared with control group,P<0.05 was significant difference,expressed by “*”;P<0.01 was extremely significant,expressed by “**”.

圖3 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對(duì)T細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.3 Effect on T cells morphology by Amanita caesarea polysaccharide (AC-1)注：1為空白對(duì)照組，2～5為AC-1藥物組，其終濃度分別為1.25、2.5、5、10 μg/mL，6為L(zhǎng)PS陽(yáng)性對(duì)照組(5 μg/mL)，細(xì)胞放大倍數(shù)(10 ×20)。Note:1 was control group.2-5 were AC-1 group,the final concentration were 1.25,2.5,5,10 μg/mL,respectively.6 was LPS positive control group (5 μg/mL),cell magnification (10 ×20)

2.1.2 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對(duì)B淋巴細(xì)胞增殖的影響

B細(xì)胞是在骨髓中發(fā)育和分化的一種淋巴細(xì)胞，能夠參與機(jī)體的體液免疫，對(duì)于維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)具有重要作用。AC-1對(duì)B細(xì)胞增殖的影響如圖4所示，AC-1的終濃度為1.25～10 μg/mL時(shí)均能夠促進(jìn)B細(xì)胞的增殖，且濃度為5 μg/mL時(shí)促進(jìn)B細(xì)胞增殖的效應(yīng)最好。同等濃度下(5 μg/mL)，B細(xì)胞在AC-1作用下的增殖率(36.98%)高于LPS作用下的增殖率(17.30%)。細(xì)胞與藥物共培養(yǎng)24 h后B細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)如圖5所示，在AC-1濃度為1.25～5 μg/mL時(shí)，隨著濃度的增加，B細(xì)胞的數(shù)量增多，成團(tuán)變大。以上結(jié)果表明，AC-1可顯著刺激B細(xì)胞的增殖及成團(tuán)，在機(jī)體的體液免疫方面具有重要的作用。

圖4 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對(duì)B淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effect on the proliferation of B cells by Amanita caesarea polysaccharide (AC-1)注：與空白對(duì)照組相比，P<0.05為差異性顯著，用“*”表示；P<0.01為差異性極顯著，用“**”表示。Note:Compared with control group,P<0.05 was significant difference,expressed by “*”;P<0.01 was extremely significant,expressed by “**”.

圖5 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對(duì)B細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.5 Effect on B cells morphology by Amanita caesarea polysaccharide (AC-1)注：1為空白對(duì)照組，2～5為AC-1藥物組，其終濃度分別為1.25、2.5、5、10 μg/mL，6為L(zhǎng)PS陽(yáng)性對(duì)照組(5 μg/mL)，細(xì)胞放大倍數(shù)(10 ×20)。Note:1 was control group.2-5 were AC-1 group,the final concentration were 1.25,2.5,5,10 μg/mL,respectively.6 was LPS positive control group (5 μg/mL),cell magnification (10×20).

2.1.3 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對(duì)B細(xì)胞分泌抗體的影響

B淋巴細(xì)胞在抗原的刺激下分化形成漿細(xì)胞，漿細(xì)胞分泌的抗體能夠?qū)⑷肭值目乖M(jìn)行清除。借助ELISA檢測(cè)試劑盒，我們對(duì)B細(xì)胞分泌抗體的情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖6至圖9所示，在濃度為2.5～10 μg/mL范圍內(nèi)，AC-1能夠促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分泌Ig A、Ig E、Ig G和Ig M抗體，但促進(jìn)Ig A和Ig G抗體分泌的最適濃度為10 μg/mL，而促進(jìn)Ig E、Ig M抗體分泌的最適濃度為2.5 μg/mL。

2.1.4 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖的影響

巨噬細(xì)胞是比較特殊的一類(lèi)免疫細(xì)胞，它既能參與機(jī)體的固有免疫，也能參與機(jī)體的特異性免疫，在免疫系統(tǒng)中具有重要的作用。AC-1對(duì)RAW264.7的效應(yīng)如圖10所示，AC-1的終濃度為1.25～10 μg/mL時(shí)，均能夠促進(jìn)RAW264.7的增殖，在濃度為5 μg/mL時(shí)對(duì)RAW264.7的增殖效應(yīng)最好。細(xì)胞與藥物共培養(yǎng)24 h后RAW264.7的生長(zhǎng)形態(tài)如圖11所示，正常狀態(tài)下的巨噬細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)并呈橢圓形，在濃度為1.25～10 μg/mL時(shí)，RAW264.7伸出偽足的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，該結(jié)果提示AC-1能夠活化RAW264.7細(xì)胞，在機(jī)體的固有免疫和特異性免疫方面具有重要的作用。

圖6 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對(duì)B細(xì)胞分泌Ig A抗體的影響Fig.6 Effect of Amanita caesarea polysaccharide (AC-1) on secretion of Ig A antibody from B cells注：與空白對(duì)照組相比，P<0.05為差異性顯著，用“*”表示；P<0.01為差異性極顯著，用“**”表示。Note:Compared with control group,P<0.05 was significant difference,expressed by “*”;P<0.01 was extremely significant,expressed by “**”.

圖7 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對(duì)B細(xì)胞分泌Ig E抗體的影響Fig.7 Effect of Amanita caesarea polysaccharide (AC-1) on secretion of Ig E antibody from B cells注：與空白對(duì)照組相比，P<0.05為差異性顯著，用“*”表示；P<0.01為差異性極顯著，用“**”表示。Note:Compared with control group,P<0.05 was significant difference,expressed by “*”;P<0.01 was extremely significant,expressed by “**”.

圖8 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對(duì)B細(xì)胞分泌Ig G抗體的影響Fig.8 Effect of Amanita caesarea polysaccharide (AC-1) on secretion of Ig G antibody from B cells注：與空白對(duì)照組相比，P<0.05為差異性顯著，用“*”表示；P<0.01為差異性極顯著，用“**”表示。Note:Compared with control group,P<0.05 was significant difference,expressed by “*”;P<0.01 was extremely significant,expressed by “**”.

圖9 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對(duì)B細(xì)胞分泌Ig M抗體的影響Fig.9 Effect of Amanita caesarea polysaccharide (AC-1) on secretion of Ig M antibody from B cells注：與空白對(duì)照組相比，P<0.05為差異性顯著，用“*”表示；P<0.01為差異性極顯著，用“**”表示。Note:Compared with control group,P<0.05 was significant difference,expressed by “*”;P<0.01 was extremely significant,expressed by “**”.

圖10 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響Fig.10 Effect on the proliferation of RAW264.7 cells by Amanita caesarea polysaccharide (AC-1)注：與空白對(duì)照組相比，P<0.05為差異性顯著，用“*”表示；P<0.01為差異性極顯著，用“**”表示。Note:Compared with control group,P<0.05 was significant difference,expressed by “*”;P<0.01 was extremely significant,expressed by “**”.

2.1.5 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬能力的影響

AC-1對(duì)RAW264.7吞噬中性紅能力的影響如圖12所示，當(dāng)AC-1的終濃度為1.25～10 μg/mL時(shí)均能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬中性紅(P<0.01)，最適濃度為2.5 μg/mL，此時(shí)吞噬率可達(dá)89.50%。同等濃度下(5 μg/mL)，AC-1刺激下RAW264.7的吞噬率(69.69%)高于LPS刺激下的吞噬率(19.34%)。以上結(jié)果進(jìn)一步表明AC-1不僅能顯著刺激RAW264.7增殖，還能顯著增強(qiáng)RAW264.7的吞噬功能，在激活機(jī)體免疫、維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面具有重要的作用。

圖11 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對(duì)RAW264.7細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.11 Effect on RAW264.7 cells morphology by Amanita caesarea polysaccharide (AC-1)注：1為空白對(duì)照組，2～5為AC-1藥物組，其終濃度分別為1.25、2.5、5、10 μg/mL，6為L(zhǎng)PS陽(yáng)性對(duì)照組(5 μg/mL)，細(xì)胞放大倍數(shù)(10×20)。Note:1 was control group.2-5 were AC-1 group,the final concentration were 1.25,2.5,5,10 μg/mL,respectively.6 was LPS positive control group (5 μg/mL),cell magnification (10×20).

圖12 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬中性紅能力的影響Fig.12 Effect of Amanita caesarea polysaccharide (AC-1) on the ability of macrophages to phagocytose neutral red注：與空白對(duì)照組相比，P<0.05為差異性顯著，用“*”表示；P<0.01為差異性極顯著，用“**”表示。Note:Compared with control group,P<0.05 was significant difference,expressed by “*”;P<0.01 was extremely significant,expressed by “**”.

2.2 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞(L929)的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

L929細(xì)胞為小鼠成纖維細(xì)胞，貼壁生長(zhǎng)，是細(xì)胞毒理性實(shí)驗(yàn)的常用細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)以L929細(xì)胞為模型探究AC-1對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖13所示，在AC-1的濃度為5～20 μg/mL時(shí)對(duì)L929細(xì)胞無(wú)顯著的增殖及抑制作用，說(shuō)明AC-1對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒性。

2.3 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)體外抗腫瘤活性

2.3.1 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對(duì)小鼠胃癌細(xì)胞(MFC)生長(zhǎng)的影響

胃癌是對(duì)人類(lèi)健康有危害的惡性腫瘤之一，致死率在全部惡性腫瘤中排第二位。AC-1對(duì)MFC細(xì)胞的影響如圖14所示，AC-1在終濃度為10～20 μg/mL時(shí)能夠抑制MFC細(xì)胞的生長(zhǎng)(P<0.01)。并且當(dāng)AC-1濃度為20 μg/mL時(shí)抑制率高達(dá)30.09%。細(xì)胞與藥物共培養(yǎng)24 h后MFC的形態(tài)如圖15所示，當(dāng)AC-1濃度為10～20 μg/mL時(shí)，隨著濃度的增加，細(xì)胞的數(shù)量逐漸變小，細(xì)胞之間的間隙變大，提示AC-1在濃度為10～20 μg/mL時(shí)能夠?qū)FC細(xì)胞骨架產(chǎn)生一定的影響，且隨著濃度的增加，效果越明顯。

2.3.2 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對(duì)小鼠肉瘤細(xì)胞(S180)生長(zhǎng)的影響

S180為小鼠肉瘤細(xì)胞(腹水瘤細(xì)胞系)，通常作為抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。AC-1對(duì)S180細(xì)胞的影響如圖16所示，當(dāng)AC-1的終濃度為5～20 μg/mL時(shí)均可顯著抑制S180細(xì)胞的生長(zhǎng)(P<0.05)。細(xì)胞與藥物共培養(yǎng)24 h后S180細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)如圖17所示，AC-1在終濃度為10～20 μg/mL時(shí)，隨著濃度的增加，細(xì)胞之間的間隙變大，提示AC-1在濃度為10～20 μg/mL時(shí)能夠直接對(duì)S180細(xì)胞產(chǎn)生抑制效果，并能夠?qū)180細(xì)胞骨架產(chǎn)生一定的影響，但其抑制效果相對(duì)于MFC細(xì)胞較弱，提示AC-1對(duì)于不同的腫瘤細(xì)胞具有不同的抑制效果，其相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

圖13 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞(L929)的影響Fig.13 Effect of Amanita caesarea polysaccharide (AC-1) on the mouse fibroblast (L929)注：與空白對(duì)照組相比，P<0.05為差異性顯著，用“*”表示；P<0.01為差異性極顯著，用“**”表示。Note:Compared with control group,P<0.05 was significant difference,expressed by “*”;P<0.01 was extremely significant,expressed by “**”.

圖14 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對(duì)小鼠胃癌細(xì)胞(MFC)的影響Fig.14 Effect of Amanita caesarea polysaccharide (AC-1) on the gastric cancer cells (MFC)注：與空白對(duì)照組相比，P<0.05為差異性顯著，用“*”表示；P<0.01為差異性極顯著，用“**”表示。Note:Compared with control group,P<0.05 was significant difference,expressed by “*”;P<0.01 was extremely significant,expressed by “**”.

圖15 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對(duì)小鼠胃癌細(xì)胞(MFC)形態(tài)的影響Fig.15 Effect on gastric cancer cells (MFC) morphology by Amanita caesarea polysaccharide (AC-1)注：1為空白對(duì)照組，2～5為AC-1藥物組，其終濃度分別為5、10、15、20 μg/mL，6為Man陽(yáng)性對(duì)照組(5 μg/mL)，細(xì)胞放大倍數(shù)(10×20)。 Note:1 was control group.2-5 were AC-1 group,the final concentration were 5,10,15,20 μg/mL,respectively.6 was Man positive control group (5 μg/mL),cell magnification (10×20).

圖16 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對(duì)小鼠肉瘤細(xì)胞(S180)的影響Fig.16 Effect of Amanita caesarea polysaccharide (AC-1) on the mouse sarcoma cells (S180)注：與空白對(duì)照組相比，P<0.05為差異性顯著，用“*”表示；P<0.01為差異性極顯著，用“**”表示。Note:Compared with control group,P<0.05 was significant difference,expressed by “*”;P<0.01 was extremely significant,expressed by “**”.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以從四川采摘的橙蓋鵝膏子實(shí)體中提取的結(jié)構(gòu)新穎的多糖AC-1為研究對(duì)象，探究了其體外免疫調(diào)節(jié)活性、細(xì)胞毒性和抗腫瘤活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AC-1能夠在體外促進(jìn)三種免疫細(xì)胞(B、T和RAW264.7)的增殖、巨噬細(xì)胞的吞噬及B細(xì)胞分泌抗體。抗體分泌實(shí)驗(yàn)表明，AC-1在較低濃度下促進(jìn)Ig E分泌的效果更明顯，而在較高濃度下促進(jìn)Ig G的分泌效果最明顯，提示AC-1在較低濃度下主要通過(guò)促進(jìn)Ig E介導(dǎo)的超敏反應(yīng)來(lái)發(fā)揮體液免疫功能，而在較高濃度下則是通過(guò)增強(qiáng)Ig G介導(dǎo)的吞噬調(diào)理等作用發(fā)揮體液免疫功能。AC-1也能在體外抑制小鼠胃癌細(xì)胞(MFC)和小鼠肉瘤細(xì)胞(S180)增殖，且對(duì)正常細(xì)胞無(wú)抑制作用，但對(duì)S180細(xì)胞的抑制效果較MFC細(xì)胞弱，提示AC-1無(wú)細(xì)胞毒性且具有良好的體外免疫調(diào)節(jié)活性和抗腫瘤活性，但對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞具有不同的抑制效果。

圖17 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對(duì)小鼠肉瘤細(xì)胞(S180)形態(tài)的影響Fig.17 Effect on morphology of the Mouse sarcoma cells (S180) by Amanita caesarea polysaccharide (AC-1)注：1為空白對(duì)照組，2～5為AC-1藥物組，其終濃度分別為5、10、15、20 μg/mL，6為Man陽(yáng)性對(duì)照組(5 μg/mL)，細(xì)胞放大倍數(shù)(10×10)。 Note:1 was control group,2-5 were AC-1 group,the final concentration were 5,10,15,20 μg/mL,respectively,6 was Man positive control group (5 μg/mL),cell magnification (10×10).

張茜[11]研究發(fā)現(xiàn)，香菇多糖和銀耳多糖在低于10 μg/mL不能促進(jìn)巨噬細(xì)胞RAW264.7的增殖，也不能促進(jìn)T、B細(xì)胞增殖。而本實(shí)驗(yàn)的橙蓋鵝膏多糖(AC-1)在1.25～10 μg/mL都能刺激B、T細(xì)胞和RAW264.7的增殖，提示AC-1在此濃度下免疫增殖效果要優(yōu)于香菇多糖和銀耳多糖。巨噬細(xì)胞是重要的抗原遞呈細(xì)胞，而吞噬功能是巨噬細(xì)胞發(fā)揮遞呈抗原功能的基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明AC-1能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬，增強(qiáng)其抗原遞呈功能。體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)比較，AC-1在濃度為20 μg/mL時(shí)，對(duì)小鼠胃癌細(xì)胞(MFC)的抑制率為30.09%，高于黃蓋鵝膏多糖濃度為40 μg/mL時(shí)對(duì)人胃癌細(xì)胞(MGC)的抑制率16.47%[5]，造成這兩種多糖活性的差異的原因可能與兩者的結(jié)構(gòu)、分子量以及純度等具有較大的關(guān)系。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在濃度為2.5～10 μg/mL范圍內(nèi)，AC-1能夠促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分泌Ig A、Ig E、Ig G和Ig M抗體，但促進(jìn)Ig A和Ig G抗體分泌的最適濃度為10 μg/mL，而促進(jìn)Ig E、Ig M抗體分泌的最適濃度為2.5 μg/mL，該結(jié)果提示不同濃度的橙蓋鵝膏多糖(AC-1)能導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞分泌免疫球蛋白(Ig)發(fā)生類(lèi)別轉(zhuǎn)換。Ig類(lèi)別轉(zhuǎn)換是指在抗原或共刺激分子的作用下導(dǎo)致B細(xì)胞發(fā)生由產(chǎn)生Ig M抗體向產(chǎn)生Ig A、Ig G和Ig E轉(zhuǎn)變的行為[12]。Ig類(lèi)型的轉(zhuǎn)換會(huì)受局部微環(huán)境和細(xì)胞因子的影響和調(diào)節(jié)，例如低濃度的卵清蛋白(OVA)主要誘導(dǎo)產(chǎn)生Ig E和Ig G1，高濃度卵清蛋白(OVA)主要誘導(dǎo)產(chǎn)生Ig G2a[13]；低濃度的竹節(jié)參醇提物(HBsAg)主要誘導(dǎo)產(chǎn)生Ig G1，而高濃度的竹節(jié)參醇提物(HBsAg)主要誘導(dǎo)產(chǎn)生Ig G2b[14]；同樣，IL-4在低濃度時(shí)主要誘導(dǎo)產(chǎn)生Ig G1，而在高濃度時(shí)則主要誘導(dǎo)產(chǎn)生Ig E[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AC-1在濃度為2.5 μg/mL時(shí)能誘導(dǎo)B細(xì)胞分泌的Ig向Ig E、Ig M類(lèi)別轉(zhuǎn)換，而在濃度為10 μg/mL時(shí)能誘導(dǎo)B細(xì)胞分泌的Ig向Ig A、Ig G類(lèi)別轉(zhuǎn)換，相關(guān)分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

一般認(rèn)為，以β-(1→3)(1→6)或以β-(1→4)(1→6)糖苷鍵連接的多糖活性較強(qiáng)，因?yàn)榇朔N構(gòu)型有利于形成三股繩狀螺旋立體構(gòu)型，顯示較高的免疫活性和抗腫瘤活性[16]。例如以β-(1→3)-D葡聚糖為主鏈的香菇多糖、豬苓多糖和奇果菌多糖均具有提高機(jī)體免疫和抗腫瘤的功能[16]；也有研究表明，以α-D葡聚糖為主的多糖也具有抗腫瘤活性，如對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)均具有抑制作用的松茸多糖就以α-(1→6)-D葡萄糖為主鏈[17]，本研究結(jié)果表明以α-(1→4)和α-(1→3)-D葡萄糖為主鏈的AC-1也具有較好的免疫調(diào)節(jié)活性和抗腫瘤活性，提示多糖的活性也受到側(cè)鏈單糖種類(lèi)和高級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。

真菌多糖具有多種生物活性，但具體發(fā)揮哪種活性與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞密切相關(guān)。例如具有β-(1→3)-D葡聚糖主鏈的香菇多糖，能夠通過(guò)MyD88依賴(lài)的NF-кB途徑解除免疫抑制[18]；具有β-(1→3)和β-(1→6)-D葡聚糖的茯苓多糖，通過(guò)NF-кB/MAPK信號(hào)通路激活巨噬細(xì)胞釋放NO[19]；具有β-(1→3)和β-(1→6)葡聚糖的灰花樹(shù)多糖通過(guò)Dectin-1/Sky/NF-кB信號(hào)通路活化巨噬細(xì)胞，使其分泌TNF-α和IL-6，達(dá)到抑瘤效果[20]。綜上可以看出，NF-кB途徑在β-葡聚糖發(fā)揮免疫作用中扮演重要的角色，然而NF-кB在以α-D-葡萄糖為主鏈的AC-1發(fā)揮生物活性時(shí)是否具有同樣的作用，則有待進(jìn)一步進(jìn)行探究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：AC-1具有在體外增強(qiáng)免疫應(yīng)答和抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的功能，且對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒副作用，這為橙蓋鵝膏多糖(AC-1)作為抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)，但其與細(xì)胞表面的何種受體結(jié)合以及信號(hào)如何進(jìn)行傳遞則有待進(jìn)一步探究。