熊俊垚，趙 款，于 芳，楊勇博，田志軍，蔡雪輝，安同慶

(中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱150069)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由PRRS 病毒(PRRS virus，PRRSV)引起的以妊娠母豬繁殖障礙和仔豬呼吸癥狀為主要特征的傳染病。該病流行范圍廣，對世界養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的危害。我國于1996 年首次分離到PRRSV，即CH-1a 株[1]。隨后幾年中，PRRSV 蔓延到我國各主要養(yǎng)豬省份。2006 年，我國暴發(fā)了高致病性PRRS (Highly pathogenic PRRS，HP-PRRS)，其具有傳播迅速、發(fā)病率和死亡率高等特點，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失[2]。

PRRSV 屬于動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬成員。其基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，全長約15 kb，5' 端有帽子結(jié)構(gòu)，3' 端有poly(A)尾巴結(jié)構(gòu)，基因組至少編碼9 個開放性閱讀框(Open reading frames， ORFs)， 包括 ORF1a、 ORF1b、 ORF2、ORF2a、ORF3～ORF7[3-4]。在PRRSV 復制過程中，首先合成自身的RNA 依賴性RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)結(jié)合到3'-UTR(Untranslated region，UTR)上，才能開始病毒負鏈基因組的合成，隨后以負鏈基因組為模板，合成子代病毒的基因組[5-7]。已有研究表明，與經(jīng)典PRRSV 相比，HP-PRRSV 復制效率在非洲綠猴胚胎腎細胞(Marc-145)和豬肺泡巨噬細胞(PAM)中高出10～100倍左右[8]。

本研究對HP-PRRSV 和經(jīng)典PRRSV 進行序列比對，發(fā)現(xiàn)前者3'-UTR 中存在規(guī)律性的堿基缺失。但目前關于PRRSV 3'-UTR 的研究較少，該缺失對病毒復制的影響尚不可知。本研究基于HP-PRRSV HuN4 株感染性克隆，構(gòu)建突變體病毒，進一步研究缺失堿基對PRRSV 復制的影響，為深入研究3'-UTR 在PRRSV 復制過程中的作用提供了實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 HP-PRRSV HuN4 株感染性克隆pOK-HuN4 由本實驗構(gòu)建并保存；Marc-145 細胞由本實驗室保存。Q5 超保真DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶和T4 DNA 連接酶購自NEB 公司；X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent 購自Roche 公司；PRRSV M 蛋白單克隆抗體(MAb)由田志軍研究員惠贈；羊抗鼠IgG-FITC 購自Sigma-Aldrich 公司。膠回收試劑盒購自OMEGA 公司；質(zhì)粒大提試劑盒購自Invitrogen 公司。

1.2 PRRSV 3'-UTR 基因序列的比對分析 為了研究HP-PRRSV 和經(jīng)典PRRSV 在3'-UTR 序列上的差異，從NCBI 中下載了40 個PRRSV 3'-UTR 基因序列，其中HP-PRRSV 34 個，經(jīng)典PRRRSV 6 個，且病毒范圍廣，覆蓋我國18 個省份區(qū)域。利用DNAStar (Megalign)對40 個PRRSV 3'-UTR 基因序列進行序列比對。

1.3 病毒RNA 二級結(jié)構(gòu)預測 通過在線軟件Mfold 預測RNA 二級結(jié)構(gòu)，使用服務器默認參數(shù)：37 ℃，1 mol/L NaCl。通過預測得到CH-1、HuN4、HuN4-(17+G)和HuN4-△SL2 4 株病毒的3'-UTR 二級結(jié)構(gòu)，使用RNAviz 2.0 軟件編輯上述二級結(jié)構(gòu)。

1.4 引物設計和合成 根據(jù)PRRSV HuN4 株基因組序列(EF635006)， 使用 Oligo 7 設計 PRRSV 3'-UTR 區(qū)域的引物。引物由吉林庫美生物技術(shù)有限公司合成(表1)。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primers used in this study

1.5 突變質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 以pOK-HuN4 株感染性克隆質(zhì)粒為模板，采用(17+G)-F1/(17+G)-R1、(17+G)-F2/(17+G)-R2 為引物分別擴增并命名為A、B 片段，△SL2-F1/△SL2-R1、△SL2-F2/△SL2-R2為引物分別擴增并命名為C、D 片段(圖1)。PCR 反應條件為：98 ℃30 s；98 ℃10 s、54 ℃30 s、72 ℃1 min，共35 個循環(huán)；72 ℃10 min。經(jīng)電泳鑒定并膠回收A、B、C 和D 片段后，以A 和B 片段為模板，(17+G)-F1/(17+G)-R2 為引物進行融合PCR，融合PCR 產(chǎn)物命名為AB 片段，反應條件同上；以C和D 片段為模板，△SL2-F1/△SL2-R2 為引物進行融合PCR，融合PCR 產(chǎn)物命名為CD 片段，反應條件同上。電泳鑒定后分別膠回收AB 和CD 片段，以AscⅠ和MluⅠ雙酶切AB 和CD 片段，分別克隆至pOK-HuN4，構(gòu)建突變質(zhì)粒pOK-HuN4-3'-UTR-(17+G)，pOK-HuN4-3'-UTR-△SL2。將親本質(zhì)粒pOKHuN4 以及突變質(zhì)粒pOK-HuN4-3'-UTR-(17+G)和pOK-HuN4-3'-UTR-△SL2 分別以(17+G)-F1/(17+G)-R2、(17+G)-F1/(17+G)-R2、△SL2-F1/△SL2-R2 為引物進行PCR 鑒定。同時將突變質(zhì)粒pOK-HuN4-3'-UTR-(17+G)和pOK-HuN4-3'-UTR-△SL2 送于吉林庫美生物技術(shù)有限公司測序鑒定。

圖1 突變體HuN4-3'-UTR-(17+G)和HuN4-3'-UTR-△SL2 的構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic representation of the construction of mutants HuN4-3'-UTR-17+G and HuN4-3'-UTR-△SL2

1.6 突變病毒的拯救及間接免疫熒光試驗(IFA)檢測 將Marc-145 細胞均勻鋪于6 孔板中，待細胞形成80 %單層時，將質(zhì)粒pOK-HuN4、pOK-HuN4-3'-UTR-(17+G)和pOK-HuN4-3'-UTR-△SL2 根據(jù)X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent 試劑說明分別轉(zhuǎn)染Marc-145 細胞，5 d 后收獲病毒，作為病毒P0 代，拯救病毒分別命名為HuN4、HuN4-3'-UTR-(17+G)和HuN4-3'-UTR-△SL2。將P0 代病毒接種于匯合度為80 %的Marc-145 細胞中，72 h 后收獲病毒作為P1 代，以該方法直至獲取P3 代病毒液，分裝后凍于-80 ℃以備后用。將質(zhì)粒pOK-HuN4、pOK-HuN4-3'-UTR-(17+G)和pOK-HuN4-3'-UTR-△SL2轉(zhuǎn)染Marc-145 細胞，5 d 后取下層細胞加入1 mL 無水乙醇室溫固定30 min，以PRRSV M 蛋白MAb(1∶100)為一抗，以山羊抗小鼠IgG-FITC (1∶100)為二抗，采用IFA 檢測各拯救病毒HuN4、HuN4-3'-UTR-(17+G)和HuN4-3'-UTR-△SL2。

1.7 復制動力學曲線 將親本病毒HuN4、突變體病毒HuN4-3'-UTR-(17+G)和HuN4-3'-UTR-△SL2 以MOI 0.01 接種于生長至80 %單層Marc-145 細胞的6 孔板中，分別在轉(zhuǎn)染后0、24 h、48 h、72 h 和96 h收集病毒，分裝后-80 ℃保存。將不同病毒不同時間點的病毒接種于生長至80 %單層Marc-145 細胞的96 孔板中，觀察并記錄細胞產(chǎn)生細胞病變(CPE)的孔數(shù)，參照Reed-Muench 法計算病毒TCID50值，以Graphpad 軟件繪制復制動力學曲線。

1.8 統(tǒng)計學分析 以上實驗的3 次重復數(shù)據(jù)采用多重t 檢驗進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)由平均值±標準方差表示，p＜0.05 表示差異顯著，p＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 P RRSV 3'-UTR 序列的變異分析結(jié)果 將34條HP-PRRSV 3'-UTR 和6 條經(jīng)典PRRSV 3'-UTR 基因以Megalign 進行多序列比對。結(jié)果顯示，與經(jīng)典PRRSV 相比，HP-PRRSV 在3'-UTR 第17 位缺失G。其中34 株HP-PRRSV 均在3'-UTR 第17 位缺失G，表明該處缺失普遍存在于HP-PRRSV 中。

2.2 突變病毒二級結(jié)構(gòu)的預測 通過在線軟件Mfold 預測CH-1、HuN4、HuN4-(17+G)和HuN4-△SL2 病毒的3'-UTR 二級結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示HuN4 和CH-1 在二級結(jié)構(gòu)形成上有明顯差異；但HuN4-(17+G)、HuN4-△SL2 與HuN4- 在二級結(jié)構(gòu)形成上無差異(圖2)。表明HuN4 3'-UTR 中第17 位G 和第二個莖環(huán)SL2 的缺失并不改變HuN4 二級結(jié)構(gòu)。

2.3 突變質(zhì)粒的鑒定 將質(zhì)粒pOK-HuN4 以及突變質(zhì)粒pOK-HuN4-3'-UTR-(17+G)和pOK-HuN4-3'-UTR-△SL2 以相應引物PCR 擴增，結(jié)果顯示擴增片段與預期片段大小一致，分別為647 bp、648 bp 和640 bp(圖3)，同時質(zhì)粒測序結(jié)果與目的序列一致。表明正確構(gòu)建突變質(zhì)粒pOK-HuN4-3'-UTR-(17+G)和pOKHuN4-3'-UTR-△SL2。

圖3 突變質(zhì)粒HuN4-3'-UTR-(17+G)和HuN4-3'-UTR-△SL2 的PCR 鑒定Fig.3 Identification of mutated HuN4-3'-UTR-(17+G)and HuN4-3'-UTR-△SL2 plasmids by PCR

2.4 突變病毒拯救的IFA 檢測結(jié)果 通過IFA 檢測病毒HuN4、HuN4-3'-UTR-(17+G)和HuN4-3'-UTR-△SL2，結(jié)果顯示突變體病毒HuN4-3'-UTR-(17+G)和HuN4-3'-UTR-△SL2 均能夠被拯救，其中HuN4陽性對照病毒也能夠被拯救，未加入質(zhì)粒的陰性對照不能夠被拯救(圖4)。表明HuN4 3'-UTR 中第17位堿基G 和第二個莖環(huán)SL2 的缺失不影響病毒的拯救，同時第二個莖環(huán)SL2 的缺失可以作為標記疫苗的分子標簽。

2.5 突變病毒的復制動力學曲線 通過一步生長曲線研究HuN4 3'-UTR 中第17 位堿基G 和SL2 的缺失對病毒復制的影響。復制動力學曲線結(jié)果顯示，與親本病毒HuN4 相比，突變體病毒HuN4-3'-UTR-(17+G)病毒滴度較低，在感染后48 h 和96 h 二者差異顯著(p＜0.05)；同樣，與親本病毒HuN4 相比，突變體病毒HuN4-3'-UTR-△SL2 的滴度也有所降，且在感染后48 h、72 h 和96 h 二者差異極顯著(p＜0.01)(圖5)。表明HuN4 3'-UTR 中第17 位堿基G 的缺失促進了HP-PRRSV 在Marc-145 細胞中的復制水平，但第二個莖環(huán)SL2 的缺失則降低HP-PRRSV 在Marc-145 細胞中的復制水平。

圖4 突變體病毒HuN4-3'-UTR-(17+G)和HuN4-3'-UTR-△SL2 的IFA 檢測Fig.4 Identification of mutated HuN4-3'-UTR-(17+G)and HuN4-3'-UTR-△SL2 viruses by IFA

3 討 論

HP-PRRSV 以致病性強、傳播迅速和死亡率高為特點，在我國流行范圍極廣，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失。通過對HP-PRRSV 和經(jīng)典PRRSV 序列比對發(fā)現(xiàn)，HP-PRRSV 基因組具有一些新的特征，其中最顯著的特點是相比于經(jīng)典PRRSV，HP-PRRSV 的NSP2 區(qū)域缺失了30 個氨基酸，但在感染性克隆的基礎上補平該缺失之后，顯示NSP2 區(qū)域的30 個氨基酸的缺失與HP-PRRSV 的復制無關[9]；研究還表明NSP9 和NSP10 共同決定HP-PRRSV 的致病性[10]。然而調(diào)控PRRSV 復制的關鍵基因需進一步研究。

圖5 HuN4-3'-UTR-(17+G)和HuN4-3'-UTR-△SL2 突變病毒的復制動力學曲線Fig.5 The growth curve of mutated HuN4-3'-UTR-(17+G)and HuN4-3'-UTR-△SL2 viruses

在PRRSV 感染細胞過程中，首先以其基因組為基礎，合成自身的RdRp，隨后結(jié)合到3'-UTR 上，以負鏈RNA 不連續(xù)轉(zhuǎn)錄模型開始病毒負鏈RNA 的合成，隨后再以負鏈基因組為模板，啟動亞基因組的轉(zhuǎn)錄和病毒基因組的復制。有研究證明PRRSV 3'-UTR 末端序列5'-AAUU-3' 和5'-AACCA-3' 對于維持病毒亞基因組合成和感染性至關重要[7]；PRRSV 3'-UTR 和ORF7 區(qū)域形成的“相吻結(jié)構(gòu)”是病毒復制的必要因素[11]；人工合成的干擾RNA 結(jié)合的3'-UTR 基因序列，可以有效抑制PRRSV 的復制，降低病毒基因滴度[12]。由此可見，3'-UTR 在PRRSV的復制過程中起到了非常關鍵的調(diào)控作用。但是目前對PRRSV 3'-UTR 的研究較少，也未能找到3'-UTR 中調(diào)控PRRSV 復制的關鍵基因，因此對PRRSV 3'-UTR 的研究變的尤為重要。

本研究基于本實驗室構(gòu)建的HP-PRRSV HuN4株感染性克隆平臺，開展了對HP-PRRSV 3'-UTR 區(qū)域的研究。首先HP-PRRSV 和經(jīng)典PRRSV 3'-UTR序列比對發(fā)現(xiàn)HP-PRRSV 3'-UTR 中第17 位缺失堿基G，同時該處缺失普遍存在于HP-PRRSV 中。這與之前研究證明PRRSV 3'-UTR 中存在高度保守的一級序列結(jié)果一致[13]。隨后的突變質(zhì)粒構(gòu)建和病毒拯救實驗結(jié)果顯示HuN4-3'-UTR-(17+G)和HuN4-3'-UTR-△SL2 突變體病毒可以被拯救，且二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果表明HuN4 3'-UTR 第17 位堿基G 和第二個莖環(huán)SL2 的缺失并不改變HuN4 3'-UTR 二級結(jié)構(gòu)。最后的復制動力學試驗結(jié)果顯示與親本病毒HuN4比較，突變體病毒HuN4-3'-UTR-(17+G)呈現(xiàn)較低的病毒滴度，在感染細胞后48 h 和96 h 二者差異顯著(p＜0.05)。表明第17 位堿基G 的缺失增強了HP-PRRSV 的復制能力，這可能由于3'-UTR 第17位堿基的缺失改變了其對應區(qū)域第二個莖環(huán)SL2 的堿基組成，進而增加了復制轉(zhuǎn)錄復合體(Replication and transcription complex，RTC)與3'-UTR 的結(jié)合水平，最終引起HP-PRRSV 復制能力的增強。有研究證明PRRSV 5'-UTR 中近5' 端莖環(huán)結(jié)構(gòu)影響病毒亞基因組的轉(zhuǎn)錄和病毒基因組的復制[14]。還有研究顯示Ⅱ型PRRSV APRRSV 株3'-UTR 末端部分堿基的改變會影響病毒的復制效率[7]。同時本實驗結(jié)果還表明HuN4 3'-UTR 中第二個莖環(huán)SL2 的缺失不影響病毒拯救，可以作為標記疫苗的分子標簽。

本研究初步揭示了我國HP-PRRSV 與經(jīng)典PRRSV 3'-UTR 在一級序列組成和二級空間結(jié)構(gòu)形成上的差異，明確了第17 位堿基G 的缺失可以增強HP-PRRSV 的復制能力。本研究為深入探究PRRSV 3'-UTR 的作用機制和功能奠定了基礎。