陳春梅 羅小衛(wèi) 李坤龍 郭翠 李基興 林秀萍 劉永宏,*

(1 中國科學院南海海洋研究所，中國科學院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室，廣東省海洋藥物重點實驗室，廣州 510301；2 中國科學院大學，北京 100049)

海綿是原始的多孔多細胞動物，以過濾性捕食方式富集了大量的微生物[1]。作為海洋底棲生物，海綿的生長環(huán)境具有高鹽、高壓、避光、缺氧、寡營養(yǎng)等特點。海綿共附生真菌因受特殊生存環(huán)境的影響而含有豐富的沉默基因，可以形成獨特的生理代謝方式，從而產生結構新穎且多樣的次級代謝產物[2-4]。另外，海綿結構簡單，缺乏有效的物理防御系統(tǒng)，因此海綿共附生真菌在與宿主共同進化過程中，為構成強大的化學防御機制，保護宿主免受競爭者、捕食者以及傳染性微生物的威脅，其次級代謝產物多具有顯著的生物活性[2]。目前，人們已從海綿共附生真菌中發(fā)現(xiàn)大量結構新穎且生物活性顯著的次級代謝產物，包括生物堿、聚酮、萜烯、甾體、環(huán)肽等，具有抗腫瘤、細胞毒活性、抗病毒、抗瘧原蟲及抗菌等生物活性[5-6]。金黃色葡萄球菌是臨床常見感染的致病菌之一，具有分布廣泛、致病性強、耐藥率高等特點[7]。此外，MRSA廣泛流行，對萬古霉素耐藥性強[8]。因此尋找新型治療MRSA感染的藥物意義重大。

據(jù)文獻報道，木賊鐮刀菌(Fusarium equiseti)的主要次級代謝產物為伊快霉素(equisetin)，屬于tetramic acid化合物[9]。Tetramic acid是一類以吡咯烷-2,4-二酮為母核的一類生物堿，廣泛存在于天然產物中。從土壤真菌Fusariumsp.FN080326分離得到的(+)-fusarisetin A；從海綿Theonellasp.中分離得到的aurantosides A和B以及從雷公藤的內生真菌CryptosporiopsisCF.quercina中分離得到的cryptocin等化合物都屬于此類[10-12]。生物活性研究表明，部分tetramicacid化合物具有較好的抗腫瘤、抗病毒、抗?jié)儭⒊莺鸵志壬锘钚訹10]。本課題組多年來致力于海洋微生物來源活性先導化合物的發(fā)現(xiàn)與挖掘研究，對一株海綿來源真菌Fusarium equiseti進行了次級代謝產物及其抑菌活性研究。從中分離獲得8個化合物(圖1)，通過波譜學方法分別鑒定為：equisetin(1)、5'-epiequisetin(2)、lumichrome(3)、N-乙?；?4)、亞油酸(5)、methyl(4-hydroxyphenyl)acetate(6)、methyl(2-hydroxyphenyl)acetate(7)和graminin B(8)。抑菌活性研究表明，化合物1、2和5對金黃色葡萄球菌和MRSA具有一定的抑制活性。

1 材料和方法

1.1 實驗儀器與試劑

AVANCE 700核磁共振儀(德國Bruker公司)；高效液相色譜儀(Hitachi公司)；中壓色譜儀(Buchi公司)；EYELAN-1001型旋轉蒸發(fā)儀(上海愛郎儀器有限公司)；SHZ-CB型循環(huán)水真空泵(鞏義市予華儀器有限公司)；KQ-250DB型超聲儀(鞏義市予華儀器有限公司)；立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋(合肥華泰醫(yī)療器械有限公司)；薄層硅膠板(煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司)；硅膠H(青島海洋化學儀器廠)；96孔細胞培養(yǎng)板(美國Corning公司)。提取分離所用試劑石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇等均為化學純，購自廣州化學試劑廠，液相色譜乙腈、甲醇為色譜純(美國Merck公司)。

1.2 菌株鑒定

圖1 化合物1～8的結構式Fig.1 The structures of compounds 1～8

菌株分離自廣東湛江徐聞縣采集的美麗屬海綿(Callyspongiasp.)的新鮮組織中，編號為SCSIO 41019，標本保存于中國科學院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室。菌株18S rDNA序列由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測定，將其ITS序列進行BLAST分析，其與菌株Fusarium equisetiisolate JG22 (accession No.KJ412501.1)的ITS序列相似度高達100%。此外，通過構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，最終將該菌株鑒定為Fusarium equiseti。其ITS序列如下：

CTTCCGTAGGGTGAACCTGCGGAGGGATCA TTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCTGTGAA CATACCTATACGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGC GCCCCGTAAAACGGGACGGCCCGCCCGAGGAC CCCTAAACTCTGTTTTTAGTGGAACTTCTGAGTA AAACAAACAAATAAATCAAAACTTTCAACAACG GATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCA GCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATT CAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCG CCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAG CGTCATTTCAACCCTCAAGCTCAGCTTGGTGTTG GGACTCGCGGTAACCCGCGTTCCCCAAATCGATT GGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAATC ATACACCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACG CCGTAAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCG GATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATA TCAATAAGTCGGAGGAA

1.3 菌株發(fā)酵

采用大米培養(yǎng)基(大米125g，海鹽2g，蒸餾水150g，pH7.4)進行發(fā)酵，在116℃下高壓蒸汽滅菌20min，冷卻后接種，共發(fā)酵48瓶，室溫靜止培養(yǎng)30d。

1.4 代謝產物的提取分離

菌株發(fā)酵結束后將大米搗碎，加入等體積乙酸乙酯，超聲20min，提取液經濃縮后得棕紅色浸膏約50g。然后用100～200目硅膠拌樣，經中壓柱色譜分離(石油醚/CH2Cl2, 100:0～0:100和CH2Cl2/CH3OH, 100:0～1:1)梯度洗脫后經TLC檢識合并得8個流份。Fr.6經ODS中壓反相柱色譜(CH3CN/H2O, 10:90～100:0)分離得10個子流份，其中Fr.6-7再用半制備液相(CH3CN/H2O, 65:35)得到化合物1(58mg)和2(133mg)。Fr.2經半制備液相(CH3CN/H2O, 77:23)得到化合物5(7mg)、6(67mg)和7(144mg)。Fr.8經ODS中壓反相柱色譜(CH3CN/H2O, 10:90～100:0)分離得5個子流份，F(xiàn)r.8-2用半制備液相(CH3OH/H2O, 32:68)得到化合物3(5mg)，4(5mg)和8(20mg)。

1.5 抑菌活性測定

1.5.1 濾紙片瓊脂擴散法篩選抑菌活性化合物

將待測化合物配成濃度為10mg/mL的甲醇溶液，陽性對照氨芐西林配成0.64mg/mL的甲醇溶液。分別用移液槍吸取10μL待測化合物溶液于直徑為6mm的無菌濾紙片上，待甲醇揮干后，將載樣濾紙片貼于已涂布100μL×106CFU/mL菌懸液的LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、瓊脂粉18g、海鹽10g、蒸餾水1L、pH7.4)上，25℃條件下倒置培養(yǎng)24h，每12h觀察一次是否產生抑菌圈。以氨芐西林作為陽性對照藥物，甲醇作為陰性對照。

圖2 基于ITS序列構建的SCSIO 41019與其他鐮刀菌屬部分代表菌株的Neighbor-joining系統(tǒng)進化樹Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree based on ITS sequences showing relationships between strain SCSIO 41019 and closely related members of genus Fusarium

1.5.2 改良肉湯稀釋法測定MIC值

對于活性篩選中顯示出抑菌活性的化合物，進一步采用改良肉湯稀釋法測定MIC。用甲醇分別將待測化合物和陽性對照藥物溶解并配至濃度為5.000、2.500、1.250、0.625、0.312、0.156、0.078、0.039、0.020、0.010、0.005mg/mL和1.250、0.625、0.312、0.156、0.078、0.039、0.020、0.010、0.005、0.0025和0.0013mg/mL共11個濃度的稀釋液。于96孔細胞培養(yǎng)板加入20μL各濃度待測化合物、80μLLB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，海鹽10g，蒸餾水1L，pH7.4)和100μL×106CFU/mL菌懸液，平行3組。以氨芐西林作為陽性對照藥物，甲醇作為陰性對照。25℃培養(yǎng)12～48h，每12h觀察各孔細菌的生長情況，對比陽性對照、陰性對照觀察，無細菌生長培養(yǎng)孔中的最小濃度即為該化合物對病原菌的MIC值。

2 結果

2.1 化合物結構鑒定

化合物1：[α]25D=-260(c 0.10, CH3OH);1H NMR (700MHz, CD3OD)δH: 5.36～5.43(2H, m, H-4, H-5), 5.18～5.26(2H, m, H-13, H-14), 3.92(2H, qd,J=16.8, 3.5Hz, H-6'), 3.67(1H, br s, H-5'), 3.35(1H, m, H-3), 3.04(3H, s, H-7'), 2.01 (1H, brs, H-10a), 1.89～1.70 (4H, m, H-7, H-9), 1.52(3H, d,J=6.3Hz, H-15), 1.47(3H, s, H-12), 1.11 (2H, m, H-6, H-10b), 0.94(3H, d,J=9.1Hz, H-16), 0.87(1H, m, H-11);13C NMR(175MHz, CD3OD)δC: 198.5(C, C-4'), 192.6(C, C-1), 177.9(C, C-2'), 132.3(CH, C-5/C-13), 131.1(CH, C-5/C-13), 127.9(CH, C-4/C-14), 127.8(CH, C-4/C-14), 102.2(C,C-3'), 69.3(CH, C-5'), 59.9(CH2, C-6'), 49.8(C, C-2), 46.4(CH, C-3), 43.6(CH2, C-7), 41.4(CH, C-11), 39.9(CH, C-6), 36.9(CH2, C-9), 34.8(CH, C-8), 29.4(CH2, C-10), 27.3(CH3, C-7'), 23.0(CH3, C-16), 18.1(CH3, C-15), 14.5(CH3, C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道基本一致，故將化合物1鑒定為equisetin。

化合物2：[α]25D=-105(c 0.10, CH3OH);1H NMR (700MHz, CD3OD)δH: 5.33～5.41(2H, m, H-4, H-5), 5.33(1H, m, H-13), 5.13(1H, brs, H-14), 3.93(2H, q,J=11.2Hz, H-6'), 3.69(1H, brs, H-5'), 3.35(1H, m, H-3), 3.04(3H, s, H-7'), 2.00(1H, brs, H-10a), 1.88～1.69(4H, m, H-7, H-9), 1.50(3H, d,J=6.3Hz, H-15), 1.48(3H, brs, H-12), 1.07～1.14(2H, m, H-6, H-10b), 0.94(3H, d,J=9.1Hz, H-16), 0.88(1H, m, H-11);13C NMR(175MHz, CD3OD)δC: 198.3(C, C-4'), 192.1(C, C-1), 177.9(C, C-2'), 131.8(CH, C-5/C-13), 130.9(CH, C-5/C-13), 128.7(CH, C-4/C-14), 127.9(CH, C-4/C-14), 102.2(C, C-3'), 69.0(CH, C-5'), 59.3(CH2, C-6'), 49.9(C, C-2), 46.1(CH, C-3), 43.6(CH2, C-7), 41.3(CH, C-11), 39.9(CH, C-6), 36.9(CH2, C-9), 34.7(CH, C-8), 29.5(CH2, C-10), 27.3(CH3, C-7'), 23.0(CH3, C-16), 18.1(CH3, C-15), 14.8(CH3, C-12)。該化合物的波譜數(shù)據(jù)與化合物1相似，其中1H NMR中δH: 3.93(2H, q,J=11.2Hz, H-6')和13C NMR中δC: 69.0(CH, C-5'), 59.3(CH2, C-6')與化合物1有細微差別，以上數(shù)據(jù)與文獻[9,13]報道基本一致。因此鑒定化合物2為equisetin的差向異構體5'-epiequisetin。

化合物3：1H NMR(700MHz, DMSO-d6)δH: 7.84(1H, s, H-6), 7.63(1H, s, H-9), 2.46(3H, s, H-11), 2.43(3H, s, H-12);13C NMR(175MHz, DMSO-d6)δC: 161.9(C, C-4), 152.5(C, C-2), 150.8(C, C-10a), 149.2(C, C-9a), 143.7(C, C-5a), 142.4(C, C-8), 137.8(C, C-7), 130.8(C, C-4a), 128.6(CH, C-6), 125.8(CH, C-9), 20.2(CH3, C-12), 19.6(CH3, C-11)。該化合物的波譜數(shù)據(jù)與文獻[14]報道的lumichrome基本一致，故化合物3鑒定為lumichrome。

化合物4：1H NMR(700MHz,CD3OD)δH: 7.54(1H, d,J=7.7Hz, H-4), 7.32(1H, d,J=8.4Hz, H-1), 7.08(2H, m, H-3, H-7), 7.00(1H, td,J=7.7, 1.1Hz, H-2), 3.46(2H, t,J=7.4Hz, H-9), 2.93(2H, t,J=7.4Hz, H-10), 1.91(3H, s, H-12);13C NMR(175MHz, CD3OD)δC: 173.3(C, C-11), 138.2(C, C-6), 128.8(C, C-5), 123.3(CH, C-7), 122.3(CH, C-2), 119.6(CH, C-3), 119.2(CH, C-4), 113.3(C, C-8), 112.2(CH, C-1), 41.6(CH2, C-10), 26.2(CH2, C-9), 22.6(CH3, C-12)。該化合物的波譜數(shù)據(jù)與文獻[15]報道的N-乙酰基色胺(N-acetyltryptamine)基本一致，故化合物4鑒定為N-乙?；贰?/p>

化合物5：1H NMR(700MHz, CD3OD)δH: 5.31～5.39(4H, m, H-9, H-10, H-12, H-13), 2.78(2H, t,J=7.0Hz, H-11), 2.26(2H, t,J=7.4Hz, H-2), 2.03～2.08(4H, m, H-8, H-14), 1.60(2H, m, H-3), 1.29～1.34(14H, m, H-4, H-5, H-6, H-7, H-15, H-16, H-17), 0.91(3H, q,J=7.0Hz, H-18);13C NMR(175MHz, CD3OD)δC: 178.6(C, C-1), 130.9(CH, C-13, C-9), 129.1(CH, C-10, C-12), 35.6(CH2, C-2), 32.7(CH2, C-16), 30.7(CH2, C-7), 30.5(CH2, C-6), 30.3(CH2, C-5), 30.3(CH2, C-15), 30.2(CH2, C-4), 28.2(CH2, C-8), 28.1(CH2, C-14), 26.5(CH2, C-11), 26.3(CH2, C-3), 23.6(CH2, C-17), 14.4(CH3, C-18)。該化合物的波譜數(shù)據(jù)與文獻[16]報道的亞油酸linoleic acid基本一致，故化合物5鑒定為亞油酸。

化合物6：1H NMR(700MHz, CD3OD)δH: 7.06(2H, d,J=11.9Hz, H-2, H-6), 6.72(2H, d,J=11.9Hz, H-3, H-5), 3.64(3H, s, H-9), 3.51(2H, s, H-7);13C NMR(175MHz, CD3OD)δC: 174.5(C, C-8), 157.5(C, C-4), 131.3(CH, C-2, C-6), 126.3(CH, C-3, C-5), 116.2(C, C-1), 52.4(CH3, C-9), 40.9(CH2, C-7)。該化合物的波譜數(shù)據(jù)與文獻[17]報道的對羥基苯乙酸甲酯基本一致，故化合物6鑒定為對羥基苯乙酸甲酯(methyl(4-hydroxyphenyl)acetate)。

化合物7：1H NMR(700MHz, CD3OD)δH: 7.08(2H, m, H-4, H6), 6.76(2H, m, H-3, H-5), 3.67(3H, s, H-9), 3.60(2H, s, H-7);13C NMR(175MHz, CD3OD)δC: 174.7(C, C-8), 156.7(C, C-2), 132.0(CH, C-4), 129.4(CH, C-6), 122.5(C, C-1), 120.4(CH, C-5), 115.8(CH, C-3), 52.3(CH3, C-9), 36.4(CH2, C-7)。該化合物的波譜數(shù)據(jù)與文獻[18]報道的鄰羥基苯乙酸甲酯基本一致，故化合物7鑒定為鄰羥基苯乙酸甲酯(methyl(2-hydroxyphenyl)acetate)。

2.2 化合物抑菌活性測定

濾紙片瓊脂擴散法篩選抑菌活性化合物結果顯示(圖3)，化合物1、2、5對金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌分別具有不同程度的抑制作用。改良肉湯稀釋法測定MIC值結果顯示(表1)，化合物1、2、5的最小抑菌濃度值為2.0～125μg/mL。

3 討論

圖3 化合物1、2、5和6(10mg/mL)對病原菌作用24h的抑菌效果Fig.3 Inhibitory effects of compounds 1～2 and 5～6 (10mg/mL) against pathogenic bacteria after 24h

表1 化合物1、2和5的最小抑菌濃度值Tab.1 The MIC values of compounds 1, 2 and 5

本文從海綿來源的共附生真菌Fusarium equisetiSCSIO 41019中共分離得到8個化合物，包括2個tetramic acid類生物堿(1～2)、1個異咯嗪類生物堿(3)、1個吲哚類生物堿(4)和4個聚酮類化合物(5～8)，并測試了其對金黃色葡萄球菌和MRSA的抑制活性，其中化合物1、2和5對受試病原菌具有一定的抑菌活性。據(jù)報道，equisetin(1)具有抑菌、細胞毒和抑制HIV病毒等生物活性，是抗HIV病毒感染的重要先導化合物之一[9,13,20]。本次抑菌活性結果表明equisetin(1)對金黃色葡萄球菌和耐MRSA具有強抑制活性，MIC值分別為2.0和3.9μg/mL，但是5'-epiequisetin(2)卻表現(xiàn)出中等抑菌活性，MIC值均為31.2μg/mL，說明化合物1中5'S構型有利于提高其抑菌活性。此外，脂肪酸類化合物linoleic acid(5)在內生真菌代謝產物中較為常見且具有一定的抗菌活性，說明其可以參與形成化學防御體系保護宿主免受侵害[21-23]。本研究豐富了該菌次級代謝產物的化學多樣性，也為將equisetin類化合物開發(fā)為具有抑菌活性的先導化合物提供了一定的參考。