李曉麗 馮 龍 陳 瑜 李 勇

草魚作為泗陽(yáng)縣傳統(tǒng)的優(yōu)良淡水養(yǎng)殖品種，一直深受廣大漁農(nóng)的歡迎。但是近年來(lái)隨著水產(chǎn)集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，草魚的養(yǎng)殖放養(yǎng)密度越來(lái)越大，人工配合飼料投喂量也越來(lái)越多，導(dǎo)致養(yǎng)殖水體的水質(zhì)日益惡化。加上漁農(nóng)防病治病的意識(shí)落后，受價(jià)格影響的存塘量和環(huán)境因素的變化，導(dǎo)致草魚多種細(xì)菌性疾病如爛鰓病、赤皮病和腸炎病等愈加嚴(yán)重，甚至極少數(shù)養(yǎng)殖戶草魚養(yǎng)殖全軍覆沒(méi)，損失慘重，嚴(yán)重打擊了養(yǎng)殖戶的積極性。

經(jīng)過(guò)近三年對(duì)泗陽(yáng)縣水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌性疾病的研究發(fā)現(xiàn)，由嗜水氣單胞菌引起的草魚疾病將近占細(xì)菌性疾病的50%。因此，2018年泗陽(yáng)縣水生動(dòng)物疫病防控中心對(duì)縣域內(nèi)草魚養(yǎng)殖進(jìn)行了疫病監(jiān)測(cè)，并對(duì)具有代表性特征的病草魚進(jìn)行了病菌株分離和鑒定，將鑒定出的嗜水氣單胞菌進(jìn)行了常用抗生素藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，旨在為嗜水氣單胞菌病原引起的草魚細(xì)菌性疾病有效檢驗(yàn)與防控及相對(duì)應(yīng)的有效治療提供依據(jù)，防止藥物的濫用和誤用，避免病情的耽誤而帶來(lái)不必要的經(jīng)濟(jì)損失。

一、材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料

（1）2018年5-10月在全縣的主要草魚養(yǎng)殖場(chǎng)的不同發(fā)病塘口，選取具有典型特征的病草魚進(jìn)行分離，分離部位為血液，具體的采樣時(shí)間、地點(diǎn)、癥狀、菌株種類詳細(xì)情況見表1。

表1 菌株分離清單匯總表

（2）營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、TCBS瓊脂、脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂購(gòu)于北京路橋。氧化酶試劑盒購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司，腸桿菌和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒（比色法）（英文名API 20E）購(gòu)于梅里埃診斷產(chǎn)品（上海）有限公司，動(dòng)物用藥敏分析試劑板購(gòu)于南京菲恩醫(yī)療科技有限公司。

2.實(shí)驗(yàn)方法

（1）細(xì)菌的分離純化。樣品先用酒精棉擦拭，用滅菌的注射器抽取血液放于營(yíng)養(yǎng)湯，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24小時(shí)。在無(wú)菌條件下，用滅菌的接種環(huán)取培養(yǎng)液劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24小時(shí)。觀察菌落形態(tài)，并挑取可疑單個(gè)菌落劃線接種脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)18～24小時(shí)。

（2）API試劑條微生物鑒定。用滅菌吸管挑取單個(gè)菌落至0.85%的NaCl中制成菌液，將5mL無(wú)菌水放進(jìn)培養(yǎng)盒里，將試劑條放進(jìn)培養(yǎng)盒內(nèi)，將菌液接種到小管或者小管及小杯（CIT，VP和GEL），利用礦物油覆蓋制定的生化孔（有劃線的孔）ADH、ODC、H2S和URE。蓋上培養(yǎng)盒，于35～37℃孵育18～24小時(shí)，同時(shí)做氧化酶實(shí)驗(yàn)構(gòu)成第21個(gè)實(shí)驗(yàn)。孵育后根據(jù)判讀表判斷各反應(yīng)結(jié)果，參照生化譜手冊(cè)，得到鑒定結(jié)果，同時(shí)參照NCCLs和CLSI標(biāo)準(zhǔn)對(duì)藥物的敏感性及耐藥性進(jìn)行判斷。

（3）病原菌的藥敏實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)12株致病性嗜水氣單胞菌進(jìn)行了抗菌素感受性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)步驟如下：挑取純化后的單個(gè)菌落于5mL生理鹽水中，制成0.5麥?zhǔn)蠁挝粷舛鹊木鷳乙褐瞥葾管；取2支10mL的無(wú)菌生理鹽水，打開任意一瓶，以無(wú)菌的方式向陰性對(duì)照孔分別加入200μL的無(wú)菌生理鹽水；從A管中吸取200μL菌懸液加入到打開的10mL無(wú)菌生理鹽水中制成B管。將B管所有菌液倒入到經(jīng)滅菌的V形槽中，再將另一支10mL無(wú)菌生理鹽水倒入V形槽中?；炀螅梦⒘恳埔浩魑形槽中的菌液加入到所有微孔中（陰性對(duì)照除外）200μL；將加樣好的藥敏分析試劑板放入28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～28小時(shí)，經(jīng)肉眼觀察證實(shí)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)試管中的最低藥物濃度，孔內(nèi)液體渾濁為陽(yáng)性（+），孔內(nèi)液體澄清為陰性（-），最低藥物濃度即藥物的最小抑菌濃度（MIC）。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 嗜水氣單胞菌分離及形態(tài)特征觀察

從病魚血液分離到的嗜水氣單胞菌在基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)瓊脂上為光滑、濕潤(rùn)、微凸、無(wú)色菌落，在脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂平板上，菌落呈乳白色、微凸、濕潤(rùn)，周圍出現(xiàn)清晰的透明圈。

2. 嗜水氣單胞菌的氧化酶試驗(yàn)和生理生化鑒定

對(duì)分離的細(xì)菌進(jìn)行生理生化檢測(cè)，結(jié)果判定為嗜水氣單胞菌的具體生理生化特征見表2。對(duì)分離到的嗜水氣單胞菌進(jìn)行Ⅰ和Ⅱ分類，并分別命名為Ⅰ-1、Ⅰ-2、Ⅰ-3和Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3、Ⅱ-4、Ⅱ-5、Ⅱ-6、Ⅱ-7、Ⅱ-8、Ⅱ-9。

表2 鑒定試劑條檢測(cè)結(jié)果

3.嗜水氣單胞菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

12株嗜水氣單胞菌對(duì)8種抗菌藥物的最小抑制濃度（MIC）如表3所示。12株嗜水氣單胞菌對(duì)抗菌藥物的感受性如表4所示。

表4 12株嗜水氣單胞菌對(duì)抗菌藥物的感受性

三、討論與分析

試驗(yàn)分離到的嗜水氣單胞菌分離株，對(duì)8種抗菌藥物進(jìn)行的藥敏試驗(yàn)，對(duì)草魚選用抗生素具有一定的指導(dǎo)價(jià)值。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，12株嗜水氣單胞菌對(duì)檢測(cè)的8種抗菌藥物的敏感性基本一致。嗜水氣單胞菌對(duì)恩諾沙星、硫酸新霉素和乳酸環(huán)丙沙星敏感性最高，敏感菌株率達(dá)100%，其次對(duì)氟苯尼考，敏感率為91.67%。但對(duì)紅霉素最不敏感，耐藥菌株率達(dá)100%，其次是甲砜霉素，耐藥菌株率達(dá)83.33%。因此，建議在本區(qū)域內(nèi)對(duì)嗜水氣單胞菌引發(fā)的疫病首選恩諾沙星、硫酸新霉素、乳酸環(huán)丙沙星和氟苯尼考。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥過(guò)程中，合理地選擇抗菌藥物的種類和適宜的使用濃度，對(duì)建立正確的合理用藥機(jī)制具有實(shí)際意義。從泗陽(yáng)縣草魚的病樣分離的嗜水氣單胞菌分離株對(duì)大多數(shù)抗生素類藥物表現(xiàn)出較高的敏感性，這與泗陽(yáng)縣草魚養(yǎng)殖過(guò)程中使用較少的抗生素有關(guān)。

（通聯(lián)：223700，江蘇省泗陽(yáng)縣水產(chǎn)技術(shù)指導(dǎo)站 電話：17805228015）

表3 12株細(xì)菌對(duì)8種抗菌藥物的最小抑菌濃度（MIC）對(duì)照表