亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        心臟驟停(CA)的SD大鼠復(fù)蘇后CD4+T細(xì)胞功能的改變

        2019-10-09 01:01:44幸春林朱雪梅張曉磊陸國平
        關(guān)鍵詞:研究

        幸春林 朱雪梅 張曉磊 陳 揚 陸國平

        (復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 上海 201102)

        隨著心肺復(fù)蘇(cardiopulmonary resuscitation,CPR)指南進(jìn)步,心臟驟停(cardiac arrest,CA)患者自主循環(huán)恢復(fù)(return of spontaneous circulation,ROSC)率較高,但住院患者最終存活出院率仍不理想[1-2]。CA、CPR時機體經(jīng)歷急性的強烈的非感染應(yīng)激反應(yīng)過程,全身各系統(tǒng)都發(fā)生劇烈改變,其中包括免疫系統(tǒng)。研究顯示CA患者ROSC后出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng),存在類似于膿毒癥免疫功能紊亂的表現(xiàn):(1)CPR后單核細(xì)胞HLA-DR的表達(dá)減少,且與降低的CD4+T細(xì)胞有相關(guān)性,死亡患者表達(dá)降低更明顯,存活患者的表達(dá)有恢復(fù)趨勢,且低體溫治療不能改變HLA-DR的表達(dá)狀態(tài)[3]。(2)CA患者的白細(xì)胞分泌細(xì)胞因子功能受損,且可能與CPR后第1天體內(nèi)細(xì)胞損傷后持續(xù)釋放的危險相關(guān)模式分子有關(guān)[4-5]。(3)CA后24 h時T細(xì)胞比例降低,Th1/Th2失衡[6-7]。小鼠CPR模型復(fù)蘇3 h內(nèi)腦組織中就有大量T細(xì)胞浸潤,并介導(dǎo)CPR后缺血性的神經(jīng)損傷[8]。因此免疫功能紊亂是CA患者ROSC后重要表現(xiàn)之一。

        免疫系統(tǒng)包括細(xì)胞免疫及體液免疫,其中T細(xì)胞是細(xì)胞免疫中最重要的細(xì)胞,T細(xì)胞數(shù)量減少或功能降低是重癥患者出現(xiàn)繼發(fā)感染、預(yù)后不良的重要指標(biāo)[9-10],通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能可提高膿毒癥患者的生存率[11-12]。但目前關(guān)于CPR后CD4+T細(xì)胞分泌的炎癥因子變化及表面共刺激及共抑制分子的改變研究較少,因此,本研究通過建立SD大鼠CA模型,研究外周血中促炎因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素6(interleukin 6,IL-6)、干擾素γ(Interferon γ,IFN-γ)和抗炎因子IL-4、IL-10的變化,CD4+T細(xì)胞數(shù)量及其表面分子PD-1、CD28、CTLA-4的表達(dá)情況,為進(jìn)一步研究CA后免疫改變機制和可能的治療干預(yù)方式提供參考。

        材料和方法

        實驗動物300~410 g清潔級SD大鼠,雌雄不限(上海杰思捷實驗動物有限公司,許可證號:SCXK(滬)2013-0006),本動物實驗研究得到復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

        試劑及設(shè)備流式試劑:Anti-Rat CD3 Per-eFluor 710、Anti-Rat CD8a PE-Cy7、Anti-Human CD279(PD-1) APC、Anti-Rat CD152(CTLA-4) PE、Anti-Rat CD28 FITC(美國eBioscience公司)、V450 Mouse Anti-Rat CD4 (美國BD公司),ELISA 試劑盒:TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-6(杭州聯(lián)科生物公司);小動物呼吸機(型號:ALC-V8D,上海奧爾科特生物科技有限公司),心電監(jiān)護(hù)儀(型號:MP40,荷蘭PHILIPS公司);流式細(xì)胞儀(型號FACSCantoⅡ,美國BD公司);多功能酶標(biāo)儀(美國Bio Tek公司)。

        動物分組將SD大鼠隨機分為心臟驟停(CA)組和假手術(shù)(sham-operated,SO)組,每組24只,每組再按3、24、72 h 3個時間點分為3個亞組,每個亞組8只。CA組建立CA模型,SO組僅行氣管插管和動靜脈置管。分別于建?;虿僮骱?、24、72 h行心臟采血。

        動物模型建立參照文獻(xiàn)[13]建立CA模型。所有大鼠造模前禁食12 h,不禁水。實驗前用10%水合氯醛4 mL/kg腹腔內(nèi)注射麻醉,行氣管切開插管,股動靜脈置管及動脈血壓監(jiān)測、心電監(jiān)護(hù),穩(wěn)定10 min。在大鼠呼氣末時堵住氣管導(dǎo)管,窒息6 min后開始CPR,松開氣管導(dǎo)管,機械通氣,參數(shù)設(shè)置為呼吸頻率80 次/min,吸呼比為1∶1.5,潮氣量6~10 mL/kg,氧氣濃度100%。同時開始胸部按壓,頻率約180 次/min,按壓深度為胸骨前后徑的1/3,按壓10 s后股靜脈注射腎上腺素(0.02 mg/kg),持續(xù)按壓2 min后評估1次,若出現(xiàn)ROSC,則停止按壓,未恢復(fù)則繼續(xù)按壓。每3~5 min靜脈注射腎上腺素(0.02 mg/kg),若10 min之后還未達(dá)到ROSC標(biāo)準(zhǔn),則放棄搶救,判為復(fù)蘇失敗,復(fù)蘇失敗大鼠不納入實驗。ROSC后予補液,3 h組于3 h后直接取血,24 h和72 h組于建模3 h后撤離呼吸機,拔除氣管導(dǎo)管及動靜脈置管,縫合傷口,放置于籠內(nèi),予氧氣吸入,正常飲食及飲水,于24 h和72 h時取血,如未到實驗時間動物死亡,死亡動物不納入研究。

        CA模型成功標(biāo)準(zhǔn)心率呼吸下降,平均動脈壓降至20 mmHg (1 mgHg=0.133 kPa,下同),認(rèn)為建模成功。

        ROSC標(biāo)準(zhǔn)大鼠出現(xiàn)自主心率,MAP≥60 mmHg且持續(xù)10 min以上,心律恢復(fù)為竇性心律,認(rèn)為達(dá)到ROSC。

        外周血中T細(xì)胞表面分子表達(dá)取3個流式管(抗體管A,同型對照管B,空白對照管C),每管加100 μL 肝素抗凝血,A管按說明書劑量加入CD3、CD4、CD8、PD-1、CTLA-4、CD28共6種抗體同時標(biāo)記,B管加PE-Cy7、APC、FITC、PE標(biāo)記的同型對照、Per-eFluor 710標(biāo)記的CD3抗體、V450標(biāo)記的CD4抗體各5 μL,混勻,C管不加任何抗體,A、B管均避光孵育25 min。每管加2 mL溶血素,混勻,37 ℃放置10 min以溶解紅細(xì)胞。500×g離心10 min,棄上清液。每管加2 mL FBS,混勻,500×g離心5 min,棄上清液。每管加250 μL PBS,重懸細(xì)胞。2 h內(nèi)上機檢測。采用FlowJo軟件分析結(jié)果,根據(jù)前向散射光(forward scatter,FSC)和側(cè)向散射光(side scatter,SSC)信號選定淋巴細(xì)胞群,分析其中CD3+(即T細(xì)胞)的比例,CD4+T細(xì)胞設(shè)門為CD3+CD4+CD8-,CD8+T細(xì)胞設(shè)門為CD3+CD8+CD4-,并分別分析CD4+T細(xì)胞表面CD28、CTLA-4、PD-1的表達(dá)(圖1)。

        ELISA檢測運用ELISA法檢測大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10、IFN-γ、IL-4的濃度。按照聯(lián)科生物公司試劑盒的Protocol操作,多功能酶標(biāo)儀在450 nm處檢測吸光度值(D)。

        結(jié) 果

        各組基線特征與生理學(xué)參數(shù)各組大鼠性別、體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義,各組大鼠的基線特征:呼吸、心率、平均動脈壓差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05,表1)。誘導(dǎo)CA時間為(226±28) s,非干涉時間為(136±26) s,CPR時間為(168±115) s。實驗各組基線特征可比,組間個體差異較小。

        促炎因子水平CA組血清中TNF-α的濃度在3 h和24 h時均高于SO組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。IL-6在CA后3 h時最高,在3 h (P=0.001)和24 h(P=0.005)均顯著高于SO組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,到72 h后IL-6降低至與SO組無統(tǒng)計學(xué)差異。IFN-γ的濃度3 h時較SO組高,在24 h和72 h時降低,顯著低于SO組(P<0.001,P=0.018,圖2)。

        抗炎因子水平CA組血清中IL-10的變化與IL-6一樣,在CA后3 h時最高,在3 h(P=0.015)和24 h(P<0.001)均顯著高于SO組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,到72 h后IL-6降低至與SO組無統(tǒng)計學(xué)差異。而IL-4在3個時間點(3、24、72 h)均顯著高于SO組(P=0.002,P=0.028,P=0.021,圖3)。

        T細(xì)胞數(shù)量及表面分子表達(dá)CA組的T細(xì)胞在ROSC后3 h已經(jīng)開始降低,到24 h和72 h時顯著低于SO組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.009,P=0.034,表2)。CA后3 h、24 h和72 h時3組T細(xì)胞CD4和CD8亞群比例均無顯著改變。在本實驗中,與SO組相比,CA組CD4+T細(xì)胞表面共刺激因子CD28及共抑制因子CTLA-4、PD-1在CA后24 h時均處于較高表達(dá)狀態(tài),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.037,P=0.003,P<0.001,圖4)。

        (1)P<0.05,(2)P<0.001.
        圖2 CA組和SO組大鼠在3個時間點TNF-α、IL-6、IFN-γ的含量變化
        Fig 2 Levels of TNF-α,IL-6 and IFN-γ in rats between CA group and SO group at three time points

        表1 SO組和CA組大鼠基線特征與生理學(xué)參數(shù)Tab 1 Baseline values and physiological parameters in rats of SO group and CA group

        MAP:Mean arterial pressure.

        (1)P<0.05,(2)P<0.01,(3)P<0.001.
        圖3 CA組和SO組大鼠在3個時間點IL-10和IL-4的含量變化
        Fig 3 Levels of the IL-10 and IL-4 in rats of CA group and SO group at three time points

        表2 SO組和CA組大鼠T細(xì)胞及T細(xì)胞亞群比例比較Tab 2 Comparison of T cells and subsets in rats of SO group and CA group

        (1)P<0.05,(2)P<0.01,(3)P<0.001.
        圖4 CA組和SO組在3個時間點CD28、CTLA-4、PD-1的表達(dá)
        Fig 4 The percentage of PD-1,CTLA-4 and CD28 expressed on CD4+T cells of CA group and SO group at three time points

        討 論

        在動物研究中發(fā)現(xiàn),窒息后立即發(fā)生高碳酸血癥和低氧血癥,伴短暫的心動過速、血壓升高和全身血管阻力增加,5 min后進(jìn)展為心動過緩和低血壓、低心輸出量、肺高壓、組織缺氧、乳酸酸中毒、持續(xù)加重最后導(dǎo)致CA,ROSC后雖然血液動力學(xué)、呼吸和全身代謝參數(shù)恢復(fù),但是組織尤其是內(nèi)臟器官缺氧持續(xù)存在[14]。CPR過程存在急性炎癥反應(yīng),不僅釋放致炎細(xì)胞因子(如IL-1、TNFα、IL-6等)引起類似于膿毒癥的全身炎癥反應(yīng)綜合征,同時釋放大量的炎癥抑制因子(如IL-4、IL-10、IL-1Ra等)[5,15],這些細(xì)胞因子相互作用,同時參與機體的免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)。本研究中的細(xì)胞因子均可由CD4+T細(xì)胞分泌,CD4+T細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)[16]。CA后3 h抗炎因子和促炎因子均升高,在72 h時促炎因子IL-6、TNFα與對照組無差別,IFN-γ甚至低于對照組,而抗炎因子IL-4仍高于對照組,提示在CA最初抗炎反應(yīng)和促炎反應(yīng)同時存在,3天后促炎反應(yīng)減少,抗炎反應(yīng)仍然存在。

        在創(chuàng)傷患者中最初4天淋巴細(xì)胞持續(xù)低水平與死亡率和住院天數(shù)的增加有關(guān),淋巴細(xì)胞數(shù)量不能恢復(fù)者預(yù)后差,提示淋巴細(xì)胞在創(chuàng)傷后的改變對預(yù)后很重要[17]。T淋巴細(xì)胞是淋巴細(xì)胞中最主要的細(xì)胞,Gouel等[18]對創(chuàng)傷患者的研究也證實,CD4+T細(xì)胞數(shù)量降低的患者更易繼發(fā)感染。陳永斌等[19]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞免疫功能水平與危重癥患者病情的嚴(yán)重程度有關(guān),可以作為評估危重癥患者病情的檢測指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)CA組CD3+T細(xì)胞比例在24 h和72 h時顯著低于SO組,有可能與CA后導(dǎo)致T細(xì)胞凋亡有關(guān),與Gu等[6]研究結(jié)果一致。

        T細(xì)胞的活化需要雙重信號的刺激,其中表達(dá)于T細(xì)胞表面的CD28作為共刺激因子最為重要,外周血幾乎所有CD4+T細(xì)胞和50%CD8+T細(xì)胞表達(dá)CD28,T細(xì)胞活化后CD28表達(dá)水平升高,B細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞表面的B7家族分子是其配體[20]。本研究證實CD28持續(xù)表達(dá)于CD4+T細(xì)胞表面,在CA 24 h后CD28表達(dá)顯著升高,表明在CA 24 h后CD4+T細(xì)胞活化明顯,活化功能正常。

        CTLA-4主要表達(dá)于活化的T細(xì)胞表面,與CD28具有高度同源性,但與B7親和力更強,可競爭性抑制CD28與B7結(jié)合,有效限制T細(xì)胞活化與增殖反應(yīng),應(yīng)用CTLA-4/Ig融合蛋白競爭性抑制CD28與B7結(jié)合,可發(fā)揮強的免疫作用,并已用于臨床治療[21]。在膿毒癥的動物模型中發(fā)現(xiàn)CTLA-4表達(dá)升高,阻斷CTLA-4通路能提高生存率[22]。本研究中CA組CTLA-4表達(dá)在24 h后較SO組顯著升高,與在膿毒癥研究中的改變一致,表明CA后負(fù)性調(diào)控的表達(dá)先于活化受體的表達(dá),且持續(xù)較高,T細(xì)胞處于受抑制調(diào)控狀態(tài)。

        PD-1是T細(xì)胞表面標(biāo)志物之一,主要表達(dá)于活化的T細(xì)胞表面,與配體PD-L1和PD-L2結(jié)合后可抑制T細(xì)胞增殖和產(chǎn)生IL-10、IFN-γ等,在免疫起始和效應(yīng)階段均可發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用,在小鼠膿毒癥模型中,PD-1在T細(xì)胞表面的表達(dá)率上調(diào),阻斷PD-1的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可提高大鼠對致病微生物的清除率,提高膿毒癥大鼠的生存率[23]。本研究中PD-1的表達(dá)在CA組 3 h時開始升高,在24 h時較SO組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義,且至第3天時仍處于高表達(dá)狀態(tài),說明在CA后T細(xì)胞表面的負(fù)性調(diào)節(jié)分子表達(dá)升高,且持續(xù)處于高表達(dá)狀態(tài),表明T細(xì)胞功能處于持續(xù)受抑制調(diào)控的狀態(tài),這樣的高表達(dá)狀態(tài)是否與膿毒癥一樣會造成T細(xì)胞的嚴(yán)重耗竭[24],以及對預(yù)后的影響有待于進(jìn)一步研究。

        總之,本實驗通過建立SD大鼠窒息致CA模型,研究了CD4+T細(xì)胞分泌的炎癥因子變化及表面共刺激及共抑制分子表達(dá)。證實了CA后最初3 h和24 h促炎反應(yīng)和抗炎反應(yīng)同時存在,72 h后抗炎反應(yīng)為主。 CD4+T細(xì)胞在CA 24 h時共抑制因子表達(dá)升高,處于受抑制調(diào)控狀態(tài)。

        猜你喜歡
        研究
        FMS與YBT相關(guān)性的實證研究
        2020年國內(nèi)翻譯研究述評
        遼代千人邑研究述論
        視錯覺在平面設(shè)計中的應(yīng)用與研究
        科技傳播(2019年22期)2020-01-14 03:06:54
        關(guān)于遼朝“一國兩制”研究的回顧與思考
        EMA伺服控制系統(tǒng)研究
        基于聲、光、磁、觸摸多功能控制的研究
        電子制作(2018年11期)2018-08-04 03:26:04
        新版C-NCAP側(cè)面碰撞假人損傷研究
        關(guān)于反傾銷會計研究的思考
        焊接膜層脫落的攻關(guān)研究
        電子制作(2017年23期)2017-02-02 07:17:19
        日韩精品综合在线视频| 亚洲中文字幕无码一区| 亚洲男人天堂2017| 国产偷闻隔壁人妻内裤av| 李白姓白白又白类似的套路| 色欲综合一区二区三区| 日韩av高清无码| 91精品国产高清久久久久| 亚洲天堂av一区二区三区不卡| 在线播放五十路熟妇| 亚洲av无码片在线观看| 人妻无码人妻有码不卡| 日本女同性恋一区二区三区网站| 亚洲av永久无码天堂网| 国产熟女高潮视频| 国产成人综合亚洲av| 高清不卡日本v二区在线| 亚洲乱码一区av春药高潮| 精品丝袜人妻久久久久久| 亚洲av激情久久精品人| 日本免费一区二区在线视频播放| 激情综合色综合久久综合| 国产女精品| 亚洲小少妇一区二区三区| 蜜桃av精品一区二区三区| a级毛片在线观看| 日韩毛片久久91| 亚洲精品国产av日韩专区 | av人妻在线一区二区三区| 国产精品二区一区二区aⅴ污介绍| 婷婷五月综合缴情在线视频| 国产一区二区三区免费精品| 久久这里都是精品99| 亚洲色大成网站www久久九九| 伊人久久综在合线亚洲不卡| 日本一曲二曲三曲在线| 欧美日韩精品乱国产| 国产精品久久久久久麻豆一区| 精品人妻一区二区蜜臀av| 无码国产精成人午夜视频一区二区| 射死你天天日|