陸海通, 許乾慰

(同濟(jì)大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院, 上海 201800)

0 前言

常規(guī)掃描電鏡(SEM)利用電子槍發(fā)射電子束經(jīng)聚焦后在試樣表面進(jìn)行光柵狀掃描，通過(guò)檢測(cè)電子與試樣間相互作用產(chǎn)生的信號(hào)對(duì)試樣表面的成分、形貌及結(jié)構(gòu)等進(jìn)行觀察和分析[1]。為了獲得足夠成像的信號(hào)強(qiáng)度，必須保證入射電子束在從電子槍到樣品的路徑中不被氣體散射。所以，電子轟擊路徑需處于高真空環(huán)境(<10-3Pa)，以減少氣體分子。但高真空環(huán)境的引入給SEM帶來(lái)了許多限制，主要表現(xiàn)在常規(guī)SEM不能在自然狀態(tài)下觀察潮濕的、表面受污染的微生物樣品。此外，非導(dǎo)電樣品絕緣電阻大，在電子束的連續(xù)掃描下，樣品表面逐漸積累負(fù)電荷，形成相當(dāng)高的負(fù)電場(chǎng)，排斥入射電子，二次電子發(fā)射不穩(wěn)定，且隨機(jī)偏轉(zhuǎn)二次電子軌跡，影響探測(cè)器接收，造成圖像晃動(dòng)、亮度突變、出現(xiàn)無(wú)規(guī)則的明暗條紋，即發(fā)生荷電效應(yīng)，也稱充電效應(yīng)。因此，必須鍍一層導(dǎo)電薄膜提高樣品的導(dǎo)電性，使表面的負(fù)電荷通過(guò)導(dǎo)電薄膜釋放入地以消除荷電現(xiàn)象[2]。這不但使樣品的準(zhǔn)備工作變得十分繁瑣、復(fù)雜，而且經(jīng)鍍層處理后SEM觀察到的圖像已不再是樣品表面圖像，而是鍍層表面圖像，無(wú)法保證這兩者完全相同。

為了改善上述缺點(diǎn)，環(huán)境掃描電鏡(ESEM)應(yīng)運(yùn)而生。ESEM的前身是低真空掃描電鏡，它初步提高了樣品室的氣壓(可達(dá)300 Pa)，減輕了對(duì)樣品的要求，但其性能依然無(wú)法滿足所有場(chǎng)合的要求。低真空掃描電鏡的突破在于隔離了樣品室與電子槍[3]，而ESEM進(jìn)一步擴(kuò)大了這一優(yōu)勢(shì)，采用了多重狹縫技術(shù)，能大大降低樣品室的真空度。樣品室真空度的降低導(dǎo)致傳統(tǒng)SEM二次電子信號(hào)收集裝置無(wú)法運(yùn)用，所以ESEM發(fā)展了自己的信號(hào)收集裝置，且因此又獲得了新的性能優(yōu)勢(shì)。

筆者就ESEM的工作原理、優(yōu)缺點(diǎn)以及應(yīng)用進(jìn)行探討。

1 工作原理

ESEM的主體部分還是SEM，基本工作原理與SEM相差無(wú)幾。但ESEM采用了2項(xiàng)關(guān)鍵性的技術(shù)措施，彌補(bǔ)了SEM樣品室高真空與無(wú)法觀察絕緣樣品的缺陷。

1.1 多重狹縫

ESEM在鏡筒與樣品室之間加裝狹縫以使兩者之間出現(xiàn)壓差，從而在保證電子槍、鏡筒內(nèi)部高真空度的同時(shí)，大幅度降低樣品室內(nèi)的真空度。

流體通過(guò)狹縫時(shí)會(huì)在狹縫兩側(cè)出現(xiàn)壓降。利用狹縫隔絕鏡筒和樣品室，在二者間制造壓差，就可同時(shí)滿足鏡筒的高真空要求和樣品室的低真空要求。僅僅加裝了單一狹縫的SEM稱為低真空掃描電鏡。若制造的壓差越大，所需的狹縫寬度就越小，但狹縫過(guò)窄會(huì)導(dǎo)致通過(guò)的電子數(shù)急劇減小，使作為激發(fā)成像物理信號(hào)的初始電子束強(qiáng)度嚴(yán)重削弱，從而嚴(yán)重影響儀器的成像性能。因此，低真空掃描電鏡僅能維持樣品室內(nèi)300 Pa左右的壓強(qiáng)，不能滿足科研工作的需求。

多重狹縫可制造足夠大的樣品室與鏡筒之間的壓差，與此同時(shí)將總壓差分散到各級(jí)狹縫間，所以各級(jí)狹縫不必做得過(guò)窄就可制造足夠的壓差。由于各級(jí)狹縫的距離很小，所以電子束通過(guò)的高氣壓區(qū)并不長(zhǎng)，可以滿足成像要求。加裝了多重狹縫的SEM即ESEM[4]。

1.2 二次電子探頭

SEM的信號(hào)探測(cè)器探頭上施加了幾千伏特的電壓，只能在高真空模式下工作。而ESEM的探頭在氣體壓強(qiáng)較高的環(huán)境下依然能正常工作。

ESEM成像原理見圖1。電子槍激發(fā)加速出高能電子束1從鏡筒出發(fā)，穿過(guò)壓差光闌后遇到樣品室內(nèi)的氣體分子，轟擊出電子與正離子。由于多重狹縫的存在，電子穿過(guò)的距離較短，不會(huì)對(duì)電子束的強(qiáng)度造成太大影響。電子束轟擊樣品5，產(chǎn)生背散射電子3與二次電子4以成像。又因?yàn)殡姌O板2和樣品間被施加電場(chǎng)，各種電子被吸引向電極板方向。在此過(guò)程中，電子獲得一定能量后便會(huì)轟擊氣體分子，產(chǎn)生更多電子與正離子，信號(hào)強(qiáng)度大大提高;正離子則被吸引至樣品表面，以中和入射電子的電荷，所以不必在樣品表面鍍導(dǎo)電層也不會(huì)出現(xiàn)荷電效應(yīng)，影響成像精度[5]。

圖1 ESEM中氣體放大原理示意圖

氣體二次電子探頭(GSED)的出現(xiàn)使ESEM中的二次電子探頭(SED)的性能進(jìn)一步提升[6]。圖2為GSED結(jié)構(gòu)示意圖。GSED依然安裝在SED的位置，其與SED的區(qū)別是多了抑制電極和探測(cè)環(huán)2個(gè)組件。抑制電極替代SED的電極板，探測(cè)環(huán)平行懸掛于抑制電極下方，入射電子束從探測(cè)環(huán)中穿過(guò)。抑制電極距離樣品較遠(yuǎn)，主要用于吸收入射電子束與背散射電子轟擊氣體分子產(chǎn)生的電子，減少噪聲。探測(cè)環(huán)用于檢測(cè)樣品表面產(chǎn)生的二次電子，由于探測(cè)環(huán)距離樣品近，其施加的電場(chǎng)可捕獲大多數(shù)電子束轟擊樣品產(chǎn)生的二次電子。又因?yàn)楸成⑸潆娮幽芰枯^高，且探測(cè)環(huán)面積小，所以背散射電子大多不會(huì)被探測(cè)環(huán)電場(chǎng)捕獲而產(chǎn)生太大的噪聲信號(hào)。

圖2 GSED結(jié)構(gòu)示意圖

2 儀器性能與應(yīng)用

2.1 儀器性能分析

2.1.1 性能指標(biāo)

Quanta 650 FEG型ESEM可在3種模式下工作。高真空模式，即典型SEM模式，二次電子信號(hào)分辨率可達(dá)1.0 nm，加速電壓為30 kV，樣品室氣壓小于6×10-4Pa，氣體抽空時(shí)間小于150 s。低真空模式，即低真空掃描電鏡模式，二次電子信號(hào)分辨率為1.4 nm，加速電壓為30 kV，樣品室氣壓下限小于10 Pa,上限為130 Pa。ESEM工作模式，二次電子信號(hào)分辨率依然有1.4 nm，加速電壓為30 kV，樣品室氣壓下限小于10 Pa,上限為4 000 Pa,放大倍數(shù)可在6～1 000 000調(diào)節(jié),氣體抽空時(shí)間小于270 s。樣品室溫度可改變，采用高溫樣品臺(tái)可在1 500 ℃下測(cè)試，冷卻樣品臺(tái)可在-20 ℃下測(cè)試。

2.1.2 優(yōu)勢(shì)

ESEM的優(yōu)勢(shì)在于以下4點(diǎn)：

(1) 樣品要求低。SEM無(wú)法觀察含水樣品，而ESEM對(duì)此要求不高。對(duì)ESEM來(lái)說(shuō)，金屬、高分子、無(wú)機(jī)材料、生物組織等樣品大多都可觀測(cè)。

(2) 制樣簡(jiǎn)單。由于樣品室內(nèi)充斥空氣電離的正離子，所以即使是絕緣體試樣也無(wú)須鍍導(dǎo)電層引流樣品電流。不僅簡(jiǎn)化了試驗(yàn)過(guò)程，降低了試驗(yàn)成本，而且提高了觀測(cè)的精確性。

(3) 樣品室的壓力、溫度和氣體成分可以改變，使ESEM的適用范圍和成像精度得到了進(jìn)一步提升，可更好模擬材料使用時(shí)的環(huán)境，測(cè)試其使用性能。與此同時(shí)，樣品室能保證一定的反應(yīng)環(huán)境，非常適用于連續(xù)觀察樣品的溶解、凝固、結(jié)晶、水化等動(dòng)態(tài)過(guò)程。

(4) 可以實(shí)現(xiàn)SEM沒有的像襯度。1997年，Griffin總結(jié)出ESEM與GSED所特有的電荷像襯度成像技術(shù)[7]，當(dāng)樣品與GSED距離較近時(shí), 樣品表面電荷會(huì)對(duì)GSED的偏壓產(chǎn)生影響，則所得圖像能反映樣品表面電荷的分布情況，即電荷像襯度。

2.1.3 劣勢(shì)

雖然ESEM對(duì)SEM的缺點(diǎn)進(jìn)行了改進(jìn)，但其樣品室最高氣壓依然只能達(dá)到5 kPa左右，無(wú)法達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)大氣壓。另外，低真空條件對(duì)電鏡也會(huì)造成一定的污染。ESEM依然屬于電鏡的范疇，無(wú)法避免電子束轟擊對(duì)樣品造成的損傷。

2.2 應(yīng)用

ESEM因其樣品制備簡(jiǎn)單、對(duì)樣品要求低等優(yōu)勢(shì)，在許多需求SEM優(yōu)點(diǎn)但因SEM對(duì)樣品的高要求而無(wú)法使用的研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。此外，ESEM獨(dú)特的像襯度和可模擬樣品反應(yīng)環(huán)境的優(yōu)勢(shì)進(jìn)一步擴(kuò)展了其應(yīng)用領(lǐng)域。

2.2.1 研究聚合物材料

水凝膠作為載體在藥物控釋、分離萃取、固定化酶、免疫分析等方面具有良好的應(yīng)用前景。高分子表面活性劑在采油、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。水凝膠和高分子表面活性劑均為親水性聚合物，它們?cè)谒械男蚊才c其使用特性密切相關(guān)，并且對(duì)成像的環(huán)境條件，特別是濕度條件非常敏感。通過(guò)調(diào)節(jié)ESEM樣品室的壓力、溫度、相對(duì)濕度等環(huán)境參數(shù)，使ESEM的觀察條件接近材料的使用條件，可獲得高質(zhì)量的圖像。

權(quán)雪玲等[8]在2 ℃、400 Pa、相對(duì)濕度為57%的水蒸氣環(huán)境中，觀察到熱縮溫敏水凝膠的多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(見圖3)。在2～50 ℃、300～600 Pa、相對(duì)濕度為42.5%～85.0%的變化過(guò)程中，原位觀察到溫敏水凝膠的結(jié)構(gòu)變化與退溶脹平衡響應(yīng)速度的關(guān)系。

圖3 溫敏水凝膠ESEM二次電子像

在-2 ℃、400 Pa、相對(duì)濕度為66%的水蒸氣環(huán)境中，觀察到羧甲基纖維素表面活性劑在水溶液中的膠束結(jié)構(gòu)(見圖4)。在壓力連續(xù)變化的過(guò)程中(由200 Pa增加到610 Pa，再由610 Pa減小到370 Pa)，觀察到膠束結(jié)構(gòu)隨相對(duì)濕度的變化(由33%變化到100%，再由100%變化到61%)，直觀顯示了樣品對(duì)水的敏感特性。

圖4 表面活性劑ESEM二次電子像

焦淑靜等[9]分別采用SEM與ESEM觀察聚合物水化分子狀態(tài)。結(jié)果表明，SEM觀察樣品必須經(jīng)冷凍干燥后進(jìn)行噴金處理，觀察效果不令人滿意。圖5為疏水締合聚合物和凝膠樣品冷凍干燥后的樣品SEM像，可見疏水締合聚合物樣品已經(jīng)縮聚成長(zhǎng)條狀，凝膠樣品形成平面網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，2個(gè)樣品都不能顯示水化分子的真實(shí)形態(tài)。

(a) 疏水締合聚合物

(b) 凝膠樣品圖5 冷凍干燥后的樣品SEM像

圖6、圖7為ESEM觀察疏水締合聚合物和凝膠樣品的圖像。圖6中疏水締合聚合物AP-P4表現(xiàn)為超分子絲團(tuán)狀結(jié)構(gòu)，塊狀物為樣品處理時(shí)殘余的冰晶。圖7(a)為凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，圖7(b)中白色固體為添加的金屬氧化物。顯然，ESEM的觀察效果大大優(yōu)于SEM。

圖6 AP-P4的超分子絲團(tuán)狀結(jié)構(gòu)

(a) 凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)

(b) 金屬氧化物圖7 凝膠樣品ESEM像

任桂久等[10]在研究紡織品纖維時(shí)也注意到了ESEM的優(yōu)越性。圖8展現(xiàn)了聚丙烯纖維材料研究中SEM噴金制樣與ESEM直接觀察所得圖像的區(qū)別。圖8(a)為SEM圖像，噴鍍導(dǎo)電層導(dǎo)致纖維表面形成了顆粒狀粗糙結(jié)構(gòu)，不能真實(shí)反映樣品本身的形貌特征；而在圖8(b)的 ESEM 圖像中，因未經(jīng)噴金處理，纖維表面十分光滑，沒有 SEM 圖像中的顆粒狀結(jié)構(gòu)。

(a) SEM

(b) ESEM圖8 聚丙烯纖維的表面形態(tài)

2.2.2 研究非導(dǎo)電晶體材料

非導(dǎo)電晶體內(nèi)的電荷分布取決于晶體材料的生長(zhǎng)過(guò)程、條件、晶體結(jié)構(gòu)、取向和夾雜物等多種因素。從原理上講，常規(guī)SEM是難以記錄這種電荷分布的，而ESEM特有的電荷襯度就是觀察這一現(xiàn)象的有力工具。姚琲等[11]利用ESEM對(duì)鈮酸鋰進(jìn)行研究。圖9為鈮酸鋰的截面ESEM照片。該樣品屬于穿晶解理斷裂，斷口平整，無(wú)表面形貌襯度，圖9中的竹葉狀圖案為應(yīng)力引發(fā)的電荷襯度。觀察結(jié)果顯示，這種電荷襯度會(huì)逐漸消失，這可能是由于樣品被電子束轟擊升溫，壓電效應(yīng)產(chǎn)生的電荷隨應(yīng)力消失而消除所致。

圖9 鈮酸鋰晶體的截面ESEM照片

2.2.3 研究鐵電晶體材料

某些光通信、壓電和電子材料能夠在電場(chǎng)中極化，當(dāng)電場(chǎng)消失后仍呈現(xiàn)各向異性的極化狀態(tài)，這是由于此類材料內(nèi)鐵電疇的定向排列所致。

傳統(tǒng)SEM觀察鐵電疇結(jié)構(gòu)時(shí)存在的技術(shù)難點(diǎn)是入射電子積聚產(chǎn)生荷電效應(yīng)，導(dǎo)致成像失敗。因?yàn)楫牻Y(jié)構(gòu)不會(huì)產(chǎn)生明顯的表面形貌襯度，所以不能通過(guò)噴鍍導(dǎo)電層來(lái)克服荷電效應(yīng)。而采用低加速電壓和探測(cè)電流以延緩荷電效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致疇襯度難以出現(xiàn)。提高二者參數(shù)固然可以提高疇襯度，但其壽命會(huì)變得十分短暫，幾分鐘甚至幾秒就會(huì)被荷電效應(yīng)破壞。ESEM無(wú)須鍍導(dǎo)電層就可由樣品室內(nèi)電離的氣體正離子中和樣品表面的電子，入射電子加速電壓對(duì)分辨率影響較小。由于能應(yīng)用較高的加速電壓觀察鐵電疇，因而其圖像襯度也更明顯，是研究此類材料的理想手段。

祝世寧等[12]采用ESEM觀察疇結(jié)構(gòu)，并通過(guò)改變加速電壓的方式來(lái)模擬SEM觀察狀況和ESEM觀察狀況。使用傳統(tǒng)SEM觀察疇結(jié)構(gòu)時(shí)，須采用化學(xué)腐蝕手段，利用正負(fù)疇腐蝕速率的不同來(lái)制造形貌襯度，見圖10(a)。此時(shí)電鏡處于SEM模式，所加電壓較低(15 kV)?？梢钥闯觯藭r(shí)正負(fù)疇的圖像襯度很低，僅在疇壁處的形貌襯度明顯。正負(fù)疇表面在這一觀察條件下二次電子的發(fā)射率幾乎是相同的。當(dāng)拋光樣品表面消除形貌襯度后，增加電壓至30 kV(即調(diào)至ESEM模式)，圖10(b)說(shuō)明正疇區(qū)表面轟擊出的二次電子數(shù)目明顯多于負(fù)疇區(qū)，圖像襯度十分明顯。顯然，ESEM模式相對(duì)于SEM模式觀察效率和圖像襯度都要更優(yōu)越。

(a) 腐蝕表面

(b) 拋光表面圖10 ESEM觀察LiTaO3疇襯度圖像

ESEM觀察電疇的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是表面粗糙度對(duì)圖像襯度幾乎無(wú)影響，即使在斷口處取樣的樣品，其鐵電疇的圖像襯度依然十分清晰。

2.2.4 研究金屬大氣腐蝕過(guò)程

金屬的大氣腐蝕通常會(huì)經(jīng)歷表面結(jié)露的現(xiàn)象。徐乃欣等[13]曾采用光學(xué)顯微鏡和照相裝置研究金屬表面結(jié)露的影響因素，但該研究方法無(wú)實(shí)時(shí)性，研究影響因素時(shí)無(wú)關(guān)聯(lián)性，因此應(yīng)采用更合適的研究方法。

采用ESEM模擬大氣環(huán)境研究受污染金屬表面的水膜形成過(guò)程，具有分辨率高，實(shí)時(shí)性強(qiáng)，無(wú)須對(duì)含水、含油、表面受污染的樣品進(jìn)行任何處理就可進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察等優(yōu)點(diǎn)。姚琲等[14]研究LY12鋁積油污表面的結(jié)露過(guò)程，溫度降至0 ℃時(shí)，結(jié)露先發(fā)生在油污區(qū)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，露珠逐漸變大，沿著油污區(qū)擴(kuò)展變成液膜。和無(wú)油污區(qū)相比，油漬增加了鋁表面的可浸潤(rùn)性，所以有利于液膜的形成。圖11、圖12分別為油污區(qū)、干凈區(qū)的結(jié)露狀況。

圖11 油污區(qū)的結(jié)露狀況

圖12 干凈區(qū)的結(jié)露狀況

2.2.5 研究含水生物樣品

邵曼君等[15]對(duì)于Vero細(xì)胞的研究表明，在常規(guī)SEM中觀察細(xì)胞形貌時(shí)，樣品制備比較復(fù)雜，必須經(jīng)歷下列步驟：(1) 用2%戊二醛溶液在4 ℃固定24 h，用磷酸緩沖液沖洗；(2) 用1%鋨酸溶液在4 ℃固定4 h，用磷酸緩沖液沖洗；(3) 30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度脫水(樣品在每個(gè)濃度中保持30 min)；(4) 乙酸異戊酯置換，CO2臨界點(diǎn)干燥；(5) 真空噴金。

采用ESEM時(shí)，樣品制備只需經(jīng)簡(jiǎn)單處理，即從培養(yǎng)液中取出的細(xì)胞及微載體，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗掉表面黏稠的培養(yǎng)液，并在空氣中放置一定的時(shí)間(10 min左右)后，便可放入顯微鏡進(jìn)行觀察。

為了比較制樣方法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，采用2種不同方法進(jìn)行制樣后均采用ESEM進(jìn)行觀察(見圖13)。從圖13可以看出：經(jīng)ESEM制備的貼附在微載體上的真實(shí)細(xì)胞形貌是多個(gè)細(xì)胞外膜連接在一起的細(xì)胞群；而經(jīng)過(guò)SEM樣品制備(固定、脫水、干燥、噴金)后，細(xì)胞逐漸分離，最后變成堆積在一起的細(xì)胞群，這說(shuō)明經(jīng)過(guò)SEM制樣的細(xì)胞改變了其表面形態(tài)。以上結(jié)果表明，運(yùn)用ESEM能較好地獲得細(xì)胞的真實(shí)形貌。

(a) ESEM制樣

(b) SEM制樣圖13 Vero細(xì)胞的ESEM制樣圖像和SEM制樣圖像

3 結(jié)語(yǔ)

ESEM利用多重狹縫將樣品室與電子槍分離，并改進(jìn)了探測(cè)裝置，繼承了SEM的全部?jī)?yōu)點(diǎn)，如高分辨率、大景深、高放大倍數(shù)等，并發(fā)展了新的像襯度原理，擴(kuò)展了其應(yīng)用范圍。與此同時(shí)，ESEM消除了SEM對(duì)樣品導(dǎo)電性和含水量的苛刻要求，使得可研究對(duì)象進(jìn)一步增加，也提高了觀測(cè)的精度與準(zhǔn)確性，并能連續(xù)觀察某些反應(yīng)，而無(wú)須制備多個(gè)樣品。在高氣壓、高溫度的環(huán)境里，ESEM依然可以提供高分辨率的電子圖像。若考慮到GSED的分辨率可能相比SEM稍有劣勢(shì)，那么完全可以將ESEM的GSED探頭更換為SEM所用高真空探頭，切換成經(jīng)典SEM的工作模式。在不考慮儀器制造困難程度與維護(hù)成本等因素時(shí)，ESEM完全優(yōu)于SEM。整體來(lái)看，ESEM雖然還未能達(dá)到在大氣壓下觀測(cè)的水平，且依然存在電子束損傷樣品的情況，但已經(jīng)能勝任絕大多數(shù)需高精度觀測(cè)樣品表面形貌的任務(wù)，在聚合物材料、生物樣品、壓電材料、非導(dǎo)電晶體、金屬大氣腐蝕過(guò)程等的研究中舉足輕重。