艾 惠，高培峰

（北京理工大學(xué) 分析測試中心，北京 102488）

核磁共振波譜儀（nuclear magnetic resonance，NMR）作為物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定的重要大型儀器之一，具有快速、準(zhǔn)確、無損、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，可以提供分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)和分子動(dòng)力學(xué)信息，已被廣泛應(yīng)用于分子結(jié)構(gòu)解析以及物質(zhì)理化性質(zhì)表征[1]，是從事有機(jī)化學(xué)、藥物化學(xué)、生物化學(xué)、石油化學(xué)、化學(xué)工業(yè)、材料化學(xué)、化學(xué)生物學(xué)、生命科學(xué)及食品科學(xué)等方面研究的重要工具[2-8]。

近年來，超低溫探頭得到了很大的發(fā)展，以其卓越的檢測靈敏度而得到廣泛應(yīng)用[9]。本文結(jié)合我校分析測試中心Bruker Ascend 700 MHz核磁共振波譜儀、超低溫探頭的結(jié)構(gòu)、技術(shù)指標(biāo)及應(yīng)用范圍等方面，介紹了BBO超低溫探頭在分析檢測中的應(yīng)用。

1 超低溫探頭分類及原理

探頭是連接樣品和譜儀之間的紐帶。根據(jù)雜核線圈和氫核線圈在探頭內(nèi)的位置不同，可以分為正相探頭（雜核在內(nèi)，碳譜靈敏度高）和反相探頭（氫核在內(nèi)，氫譜靈敏度高）（見圖 1）。共振頻率較低的原子核由于其γ值較小或天然豐度較低，共振信號較弱，因而接收線圈在里面可以提高靈敏度。

超低溫探頭由高溫超導(dǎo)薄膜材料制成，當(dāng)樣品溫度由溫控單元維持時(shí)，使用閉環(huán)或開環(huán)制冷系統(tǒng)使超導(dǎo)線圈冷至25 K，消除譜圖的電噪聲，提高檢測靈敏度。過去十幾年內(nèi)超低溫探頭的發(fā)展顯著增加了核磁的靈敏度，使以前認(rèn)為樣品量太少無法檢測的樣品的測試成為可能。目前應(yīng)用比較廣的兩種低溫探頭是基于閉環(huán)循環(huán)的氦冷卻器低溫探頭（CryoProbe）和開環(huán)的液氮冷卻系統(tǒng)低溫探頭（CryoProbe Prodigy）。低溫探頭工作原理，發(fā)射/接受線圈和調(diào)諧匹配電路維持在極低溫度，以降低源自導(dǎo)體中的電子熱運(yùn)動(dòng)所致的噪聲（Johnson-Nyquist噪聲）；在低溫下，純金屬的電阻進(jìn)一步下降，額外降低了噪聲；前放、過濾器和發(fā)射-接收-轉(zhuǎn)換也被冷卻，以提升電子器件的噪聲指數(shù)。探頭和電子降低的噪聲增強(qiáng)了信噪比，與常規(guī)室溫探頭相比，CryoProbe探頭信噪比最多增加 5倍，CryoProbe Prodigy增加2～3倍。冷卻系統(tǒng)控制了所有功能，一旦處于冷卻狀態(tài)，CryoProbe探頭和常規(guī)探頭一樣使用，盡管離低溫探頭的冷卻區(qū)域只有 1 mm遠(yuǎn)，樣品能夠在設(shè)定的溫度下穩(wěn)定。根據(jù)探頭不同，溫度可調(diào)范圍在-40～135 ℃之間。

圖1 反相探頭與正相探頭示意圖

2 BBO超低溫探頭應(yīng)用實(shí)例

BBO CryoProbe為正相探頭，在最廣泛的核范圍內(nèi)提供了最高的靈敏度，設(shè)計(jì)為同時(shí)觀測和反相檢測。除了1H和19F外，所有在31P和15N的NMR核都能夠被觀測/照射。所有這些核能夠自動(dòng)選擇，利用ATM選項(xiàng)進(jìn)行優(yōu)化調(diào)諧和匹配，配有主動(dòng)屏蔽的單軸Z軸梯度，用于直徑為5 mm的樣品。BBO H&F（BBO Cryo Probe）探頭設(shè)計(jì)增強(qiáng)了19F和13C的靈敏度。19F可以在1H通道內(nèi)調(diào)節(jié)到19F，不能進(jìn)行觀測1H對19F去耦（反之亦然）實(shí)驗(yàn)。除了表征的觀測BB、對1H去耦的實(shí)驗(yàn)外，BBO H&F探頭還能觀測 BB、對19F去耦。

Bruker Ascend 700 MHz 核磁共振波譜儀的BBO H&F寬頻超低溫探頭，用壓縮低溫氦氣來冷卻探頭檢測線圈到20 K附近和前放電子線圈到77 K附近，最大程度降低了可檢測到的電子熱噪聲，探頭檢測靈敏度可提高3 ～ 4倍以上，檢測時(shí)間減少16倍或者樣品濃度減少4倍，對13C靈敏度最高，對31P到15N范圍內(nèi)的靈敏度提高了 4倍多，對1H的靈敏度提高了 3倍多，對19F的靈敏度提高了6倍多。其與700 MHz BBO常溫寬頻探頭的技術(shù)指標(biāo)見表1。對于不常用核、低豐度/低靈敏度核、天然產(chǎn)物化學(xué)或代謝組學(xué)等樣品量小的檢測提供了很好的解決辦法。

表1 BBO H&F寬頻超低溫探頭與常溫寬頻探頭技術(shù)指標(biāo)

圖2是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%乙基苯用700 MHz BBO H&F寬頻超低溫探頭和400 MHz BBO常溫寬頻探頭測試C13CPD譜圖的比較（δ為化學(xué)位移）。其中，700 MHz掃描次數(shù)為16次，400 MHz掃描次數(shù)為1024次。從圖2可以看出，用700 MHz BBO H&F寬頻超低溫探頭測試靈敏度、天然豐度均很低且含量很低樣品的碳譜掃描16次即可得到分辨率很高的碳譜譜圖，而用400 MHz BBO常溫寬頻探頭測試則須掃描1024次才能達(dá)到類似的分辨率。

圖2700 MHz BBO H&F寬頻超低溫探頭（NS = 16）與400 MHz BBO常溫寬頻探頭（NS = 1024）C13CPD譜圖

圖3是僅用5.5 h采樣得到的200 μg Taxal （paclitaxel，C47H51NO14，MW = 853.9）寬帶去耦碳譜和DEPT-135譜。同時(shí)，2D HSQC譜也證明了在采樣時(shí)間僅為1 h時(shí)，BBO H&F寬頻超低溫探頭卓越的1H靈敏度，其測試結(jié)果均比 DHC超低溫探頭測試時(shí)間縮短了一倍多[9]。

圖4是在700 MHz BBO 寬頻超低溫探頭上用反轉(zhuǎn)門控去耦方法測試3 h得到的氮譜譜圖。圖5是在700 MHz BBO 寬頻超低溫探頭上測試15 min得到消除背景前后的一維11B譜圖。圖6是在700 MHz BBO寬頻超低溫探頭上測試0.5 h得到的一維119Sn和51V譜圖。圖4—圖6說明700 MHz BBO 寬頻超低溫探頭對于低靈敏度、不常用核也具有非常杰出的靈敏度。以上實(shí)例證明700 MHz BBO寬頻超低溫探頭對氫、碳及雜核均有卓越的靈敏度，是檢測低豐度/低靈敏度核、不常用核及天然產(chǎn)物化學(xué)的優(yōu)先選擇。

圖3 在700 MHz BBO H&F寬頻超低溫探頭測試得到的200 μg Taxal碳譜

圖4 在700 MHz BBO寬頻超低溫探頭上用反轉(zhuǎn)門控去耦方法測試3 h得到的15N譜圖

3 維護(hù)及開放共享服務(wù)

圖5 在700 MHz BBO寬頻超低溫探頭測試15 min得到的11B譜圖

圖6 在700 MHz BBO寬頻超低溫探頭上測試得到的一維雜核譜圖

儀器維護(hù)保養(yǎng)是一項(xiàng)經(jīng)常性的或定期的工作，也是一件技術(shù)性較強(qiáng)的工作[10]。超低溫探頭的維護(hù)保養(yǎng)需定期進(jìn)行，每10000 h需對冷柜中的冷頭和膜泵進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng)；每20000 h需對冷柜中的分子泵和室內(nèi)機(jī)中氦過濾器進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng)；每月對室外機(jī)進(jìn)行定期清理清洗，春天柳絮紛飛的季節(jié)需每周清理；定期查看監(jiān)控筆記本電腦等，保證探頭的正常運(yùn)行。

目前整臺儀器已實(shí)行開放共享服務(wù)，極大地提高了使用效率。兩年多以來，超低溫探頭的高分辨率及高靈敏度的檢測條件，為我校師生服務(wù)取得了一定的成果。我校王蘇寧教授課題組結(jié)合超低溫探頭測試核磁氫譜、碳譜、硼譜及二維譜等表征手段在 Chem.Sci.[11-12]和 Macromolecules[13]等雜志發(fā)表文章；陳甫雪教授課題組結(jié)合超低溫探頭測試核磁氮譜在 Chem.Commun.[14]雜志發(fā)表文章；李曉芳教授課題組結(jié)合超低溫探頭測試核磁氫譜和碳譜在 Macromol. Rapid Commun.[15]和Org. Lett.[16]等雜志發(fā)表文章；胡長文教授課題組結(jié)合超低溫探頭測試核磁氫譜、碳譜和磷譜在Angew. J. Org. Chem.[17]等雜志發(fā)表文章。

4 結(jié)語

核磁共振波譜儀在諸多學(xué)科和研究領(lǐng)域均得到了廣泛的應(yīng)用，也逐漸成為教學(xué)科研中的重要設(shè)備。超低溫探頭卓越的靈敏度為分析化學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、生物制藥及新材料開發(fā)等領(lǐng)域提供了一流的檢測技術(shù)，成為推動(dòng)學(xué)科發(fā)展的有力工具。