王振吉，楊申明*，許云香，周林宗

（楚雄師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 楚雄 675000）

蟲草花（Cordyceps militaris）隸屬子囊菌亞門（Ascomycotina）麥角菌科（Clavicipitaceae）蟲草屬（Cordyceps），又稱蟲草子實(shí)體、不老草、蛹蟲草等[1-2]?！跋x草花”不是蟲、不是草、也不是花，它是一種人工培養(yǎng)的蟲草子實(shí)體，屬蟲、菌結(jié)合的真菌類[3]。蟲草花中富含蛋白質(zhì)、氨基酸以及蟲草素、甘露醇、多糖等多種活性物質(zhì)[4]，對于增強(qiáng)體內(nèi)巨噬細(xì)胞功能、調(diào)節(jié)人體免疫力、提高人體抗病能力具有一定的功效。

多糖是一類大分子物質(zhì)，具有多種重要生物活性，如抗氧化[5]、抗病毒[6]、抗腫瘤[7]、抗衰老[8]、降血糖血脂[8]、調(diào)節(jié)免疫力[10]等作用，因此被廣泛應(yīng)用于食品、發(fā)酵、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域。張素斌等[11]用熱水提取法、單一酶法、超聲波法對蟲草花多糖進(jìn)行提取，并比較幾種提取方法的提取條件，在最佳提取條件下，熱水提取法、纖維素酶法、木瓜蛋白酶法和超聲波法的多糖提取率分別為18.12%、15.01%、18.57%、13.34%；賈有青等[12]用超聲波法提取蟲草花多糖，確定了蟲草花多糖較佳提取條件為料液比1∶40（g∶mL），超聲時(shí)間30 min，超聲溫度50℃，在此條件下測得蟲草花多糖提取率為4.85 g/100 g；李銀花等[13]采用正交試驗(yàn)優(yōu)化了超聲輔助提取蟲草花多糖的工藝條件為：超聲溫度80℃，超聲功率140 W，超聲時(shí)間為40 min，在此條件下測得蟲草花多糖提取率為3.46%。

本研究以蟲草花為試驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)室自制蒸餾水為提取溶劑，在考察單因素超聲功率、液料比、超聲時(shí)間、超聲溫度試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助提取蟲草花多糖的工藝條件；同時(shí)以維生素C（vitamin C，VC）為陽性對照，就蟲草花多糖對于·OH、1,1-苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrlhydrazyl，DPPH）自由基的清除作用和還原能力進(jìn)行研究，以期為深入研究蟲草花多糖特性，進(jìn)一步開發(fā)和利用蟲草花中多糖類物質(zhì)提供理論依據(jù)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蟲草花（Cordyceps militaris）：采自云南省楚雄市東華鎮(zhèn)。蟲草花依次用自來水、蒸餾水洗凈、曬干，粉碎后過40目篩，得干粉。干粉經(jīng)石油醚脫脂、脫色素處理后，50℃烘干，得去除色素和油脂的干粉，保存，備用。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：天津市優(yōu)譜化學(xué)試劑有限公司；DPPH：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；維生素C（vitamin C，VC）：昆山譜森實(shí)驗(yàn)室用品科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Alpha-1502紫外可見分光光度計(jì)：上海譜元儀器有限公司；SK8210HP型超聲波清洗器：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；CP224C型電子天平：奧豪斯儀器有限公司；SHZ-III A型循環(huán)水真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；HWS-26型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蟲草花粗多糖的制備

準(zhǔn)確稱取1.0 g處理過的蟲草花干粉，放入250 mL錐形瓶中，加入30 mL蒸餾水，在超聲溫度45℃，超聲功率300 W的超聲波中提取30 min，提取完畢后，用循環(huán)水真空泵抽濾，取上層濾液用Sevag法[14]脫除蛋白后，提取溶液加入3倍體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，將沉淀在50℃條件下進(jìn)行干燥處理，得到蟲草花粗多糖。

1.3.2 蟲草花多糖含量測定

蟲草花多糖含量測定采用苯酚-硫酸法[15]。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）對吸光度值（y）進(jìn)行線性回歸，得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=10.797x+0.0149，相關(guān)系數(shù)R2=0.9995。蟲草花多糖提取率計(jì)算公式如下：

式中：C為根據(jù)回歸方程計(jì)算出的多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；N為稀釋倍數(shù)；V為蟲草花提取液定容的體積，mL；M為蟲草花干粉的質(zhì)量，g。

1.3.3 蟲草花多糖提取工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

以多糖提取率為評價(jià)指標(biāo)，分別考察以下單因素的影響：①超聲波功率分別為200W、250W、300W、350W、400W的條件下進(jìn)行提取，液料比30∶1（mL∶g），超聲時(shí)間30 min，超聲溫度40 ℃；②液料比分別為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL∶g）的條件下進(jìn)行提取，超聲波功率300 W，超聲時(shí)間30 min，超聲溫度40℃；③超聲時(shí)間分別為10 min、20 min、30min、40min、50min的條件下進(jìn)行提取，液料比30∶1（mL∶g），超聲波功率300W，超聲溫度40℃；④超聲溫度分別為30℃、35℃、40℃、45℃、50℃的條件下進(jìn)行提取，超聲時(shí)間30min，超聲功率300 W，液料比30∶1（mL∶g）。

1.3.4 蟲草花多糖提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)篩選結(jié)果，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)，以蟲草花多糖提取率為評價(jià)指標(biāo)，考察超聲功率（A）、液料比（B）、超聲時(shí)間（C）和超聲溫度（D）4個(gè)因素對蟲草花多糖提取率的影響，正交試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 蟲草花多糖提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction technology optimization of Cordyceps militaris polysaccharides

1.3.5 蟲草花多糖抗氧化性測定

將蟲草花粗多糖分別配制成質(zhì)量濃度為0.0029mg/mL、0.0058mg/mL、0.0087mg/mL、0.0116mg/mL、0.0147mg/mL的溶液，研究其抗氧化性。

（1）蟲草花多糖對·OH的清除作用測定

·OH的清除能力測定參考陳曉寧等[16]的方法稍作修改。取2.0 mL蟲草花多糖溶液于25 mL比色管，依次加入FeSO4（6 mmol/L，2.0 mL），水楊酸-乙醇溶液（6 mmol/L，2.0 mL）和H2O2（7 mmol/L，2.0 mL），在35℃水浴中反應(yīng)25 min后，在波長536 nm處測定吸光度值記為A1；同法測定A2和對照液A0的吸光度值。同時(shí)，以相同質(zhì)量濃度的維生素C溶液作陽性對照，羥基自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：A0為空白對照液的吸光度值（蒸餾水代替樣品）；A1為樣品的吸光度值；A2為對照組（蒸餾水代替H2O2）的吸光度值。

（2）蟲草花多糖對DPPH·的清除作用測定

DPPH·的清除能力測定參考ALONSO A M等[17]的方法稍作修改。分別取2.0 mL不同質(zhì)量濃度（0.002 9 mg/mL、0.0058mg/mL、0.0087mg/mL、0.0116mg/mL、0.0147mg/mL）的蟲草花多糖溶液，加入DPPH-乙醇溶液（0.1 mmol/L，2.0 mL），混勻，室溫條件下避光反應(yīng)15 min后，并在波長517 nm處測定吸光度值。同時(shí)，以相同質(zhì)量濃度的維生素C溶液作陽性對照，DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：A0為樣品被蒸餾水代替時(shí)測定的吸光度值；A1為測定樣品蟲草花多糖溶液的吸光度值；A2為采用乙醇替換DPPH-乙醇溶液時(shí)樣品的吸光度值。

（3）蟲草花多糖還原能力的測定

還原能力的測定參考魏明等[18]的方法稍作修改。在5支比色管中分別加入不同質(zhì)量濃度（0.0029mg/mL、0.0058mg/mL、0.008 7 mg/mL、0.011 6 mg/mL、0.014 7 mg/mL）的蟲草花多糖溶液1.0 mL，依次加入磷酸緩沖液（pH=6.6，0.2 mol/L，2.0 mL），鐵氰化鉀溶液（1.0 g/mL，2.0 mL），混勻，在50℃的水浴中恒溫20 min后，冷卻至室溫后加入三氯乙酸溶液（0.1 g/mL，2.0 mL）搖勻。取2.0 mL反應(yīng)液于比色管中，依次加入2.0 mL蒸餾水和三氯化鐵溶液（1.0 g/mL，0.4 mL），室溫下反應(yīng)15min后，在波長700 nm處測定吸光度值（A700nm），以吸光度值（A700nm）的大小來衡量還原能力的強(qiáng)弱，吸光度值越大，還原能力越強(qiáng)。以蒸餾水代替樣品溶液為空白對照，以相同質(zhì)量濃度的維生素C溶液作陽性對照，每組試驗(yàn)平行進(jìn)行3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲功率對蟲草花多糖提取效果的影響

由圖1可知，蟲草花多糖提取率隨著超聲波功率在200～400 W范圍內(nèi)的增加先增大后降低。超聲功率為300 W時(shí)，蟲草花多糖提取率達(dá)到最大值為3.82%。這可能是超聲波功率大，所具有的能量較大，從而加速蟲草花中多糖的溶出；但當(dāng)超聲波功率太大時(shí)，可能會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致提取率下降。因此，確定適宜的超聲功率為300 W。

圖1 超聲波功率對多糖提取效果的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on the polysaccharides extraction effect of polysaccharides

2.1.2 液料比對蟲草花多糖提取效果的影響

由圖2可知，隨著液料比在10∶1～50∶1（mL∶g）范圍內(nèi)的增大，蟲草花多糖提取率呈先增大后減小的趨勢，當(dāng)液料比達(dá)30∶1（mL∶g）時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大為3.84%。這可能是溶劑用量的增大使細(xì)胞內(nèi)外濃度差增大，從而提高多糖提取率；當(dāng)液料比繼續(xù)增大時(shí)，多糖提取率減小，這可能是溶劑用量的增大，消耗更多的能量[19]。因此，確定適宜的液料比為30∶1（mL∶g）。

2.1.3超聲時(shí)間對蟲草花多糖提取效果的影響

圖2 料液比對多糖提取效果的影響Fig.2 Effect of liquid to solid ratio on the polysaccharides extraction effect of polysaccharides

由圖3可知，超聲時(shí)間在10～30min范圍內(nèi)，蟲草花多糖的提取率隨超聲時(shí)間的延長而增大，當(dāng)超聲時(shí)間為30 min時(shí)，提取率達(dá)到最大為3.81%；之后隨超聲時(shí)間的繼續(xù)增加，蟲草花多糖的提取率逐漸減小。這可能是因?yàn)樵诔暡ǖ倪^程中會(huì)產(chǎn)生大量的熱能，并且隨著時(shí)間增加，產(chǎn)生的熱能就越多，當(dāng)熱能超過一定的限度時(shí)，就會(huì)破壞多糖的分子結(jié)構(gòu)，使得提取率降低[20]。因此，確定適宜的超聲時(shí)間為30 min。

圖3 超聲時(shí)間對多糖提取效果的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the extraction effect of polysaccharides

2.1.4 超聲溫度對蟲草花多糖提取效果的影響

由圖4可知，隨著超聲波提取溫度的升高，蟲草花多糖提取率逐漸增大，當(dāng)超聲波溫度達(dá)到40℃時(shí)，蟲草花多糖提取率達(dá)到最大為3.85%；之后繼續(xù)升高超聲波提取溫度，蟲草花多糖提取率呈現(xiàn)下降。這可能是隨著提取溫度的升高，多糖分子運(yùn)動(dòng)加快，同時(shí)可以增加溶劑的滲透能力，提取率隨之升高，但是過高的溫度可能會(huì)對多糖分子結(jié)構(gòu)和生物活性產(chǎn)生破壞作用[21]。因此，確定適宜的超聲溫度為40℃。

圖4 超聲溫度對多糖提取效果的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the extraction effect of polysaccharides

2.2 提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，影響蟲草花多糖提取率的主次順序依次為D＞B＞A＞C，即超聲溫度＞液料比＞超聲功率＞超聲時(shí)間。蟲草花多糖的最佳提取工藝參數(shù)為A2B2C2D3，由于正交試驗(yàn)中沒有出現(xiàn)A2B2C2D3最佳組合，因此在該件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，測得蟲草花多糖平均提取率為3.88%，高于正交試驗(yàn)中的組合，因此選擇最佳提取工藝參數(shù)為超聲功率為300 W，液料比為30∶1（mL∶g），超聲時(shí)間為30 min，超聲溫度為45℃。

表2 蟲草花多糖提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction technology optimization of Cordyceps militaris polysaccharides

2.3 蟲草花多糖抗氧化性分析

2.3.1 蟲草花多糖對·OH的清除能力

蟲草花多糖對·OH清除效果隨濃度變化見圖5。由圖5可知，蟲草花多糖在質(zhì)量濃度0.002 9～0.014 7 mg/mL范圍內(nèi)，隨著蟲草花多糖質(zhì)量濃度的增加，清除·OH的能力增強(qiáng)。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為0.0147mg/mL時(shí)，對·OH的清除率可達(dá)到44.39%，與陽性對照液維生素C對·OH的清除率53.55%相比稍弱，但蟲草花多糖仍然表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除·OH的能力。

圖5 不同質(zhì)量濃度蟲草花多糖對·OH的清除效果Fig.5 Scavenging effect of different concentration of polysaccharides in Cordyceps militarison·OH

2.3.2 蟲草花多糖對DPPH·的清除能力

蟲草花多糖對DPPH·清除效果隨質(zhì)量濃度變化見圖6。由圖6可知，蟲草花多糖在質(zhì)量濃度0.002 9～0.014 7 mg/mL范圍內(nèi)，隨著蟲草花多糖質(zhì)量濃度的增加，清除DPPH·的能力增強(qiáng)。當(dāng)蟲草花多糖質(zhì)量濃度為0.0147 mg/mL時(shí)，對DPPH·的清除率可達(dá)到56.34%，與陽性對照液維生素C對DPPH·的清除率72.47%相比較弱，但蟲草花多糖依然表現(xiàn)出一定的清除DPPH·的能力。

圖6 不同濃度蟲草花多糖對DPPH·的清除效果Fig.6 Scavenging ability of different concentration of polysaccharides in Cordyceps militarison DPPH·

2.3.3 蟲草花多糖的還原能力

蟲草花多糖還原能力隨濃度變化見圖7。由圖7可知，蟲草花多糖在質(zhì)量濃度0.002 9～0.014 7 mg/mL范圍內(nèi)，蟲草花多糖還原能力隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，但與陽性對照液維生素C的還原能力相比稍弱，但蟲草花多糖依然表現(xiàn)出有良好的還原能力，從而證明了其較好的抗氧化活性。

圖7 不同濃度蟲草花多糖的還原能力Fig.7 Reducing capacity of different concentration of polysaccharides in Cordyceps militaris

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)獲得了超聲波輔助提取蟲草花多糖的最佳工藝條件為：超聲功率為300W，液料比為30∶1（mL∶g），超聲時(shí)間為30min，超聲溫度為45℃。在此優(yōu)化條件下，測得蟲草花多糖平均提取率為3.88%。

抗氧化性試驗(yàn)結(jié)果表明，蟲草花多糖在質(zhì)量濃度0.0029～0.014 7 mg/mL范圍內(nèi)，·OH和DPPH·的清除能力與多糖質(zhì)量濃度呈正相關(guān)性。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為0.0147 mg/mL時(shí)，對·OH和DPPH·的清除率可分別達(dá)到44.39%和56.34%，與陽性對照液維生素C對·OH（清除率53.55%）和DPPH·（清除率72.47%）的清除率相比稍弱，但蟲草花多糖仍然表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除·OH和DPPH·的能力；蟲草花多糖的還原能力也隨質(zhì)量濃度增大而增強(qiáng)，與同質(zhì)量濃度陽性對照液維生素C的還原能力相比稍弱，但蟲草花多糖也同樣表現(xiàn)出良好的還原能力，說明蟲草花多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性。