王春艷，宋建陽，呂慧鑫，張玉梅，范玉璞，李學(xué)思，郭書賢*

（1.南陽理工學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南 南陽 473004；2.河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽 473004；3.河南省宋河酒業(yè)股份有限公司，河南 鹿邑 477265）

白酒釀造過程實(shí)質(zhì)上是多種微生物繁殖和代謝的過程，中國傳統(tǒng)的濃香型白酒以固態(tài)發(fā)酵為特征，糖化、酒化、酯化等多種生化反應(yīng)均在窖池中完成。窖泥是微生物的載體，其復(fù)雜的微生物菌群不斷進(jìn)行自然選擇與淘汰，最終形成特有的微生態(tài)環(huán)境。窖泥微生物產(chǎn)生的廣譜代謝產(chǎn)物，對濃香型白酒復(fù)合香氣的形成起著至關(guān)重要的作用，窖泥微生物種類和數(shù)量，在一定程度上決定了濃香型白酒的質(zhì)量[1]。窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)及其變化規(guī)律的研究，能夠?yàn)閷?shí)現(xiàn)從白酒釀造“源頭”—微生物菌群改造來提高白酒品質(zhì)提供理論和技術(shù)支撐。

傳統(tǒng)研究窖泥微生物常采用菌種分離培養(yǎng)技術(shù)，該方法僅能對極少數(shù)可培養(yǎng)微生物進(jìn)行分析，難以客觀揭示窖泥微生物的多樣性。磷酸脂肪酸（phosphor lipid fatty acid，PLFA）生物標(biāo)記、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gel gradient electrophoresis，PCR-DGGE）、TA克隆文庫、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strand conformation polymorphism，SSCP）、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）等現(xiàn)代分子生物學(xué)免培養(yǎng)技術(shù)一定程度上克服了傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)的弊端，但仍存在工作量大、成本高，僅對群落中主要成分比較敏感等缺陷[2-4]。與上述方法相比，高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）技術(shù)對微生物群落結(jié)構(gòu)的研究有著明顯的先進(jìn)性和優(yōu)勢，具有成本低、通量高、覆蓋廣泛、耗時短等特點(diǎn)。其結(jié)合生物信息學(xué)分析，能更加科學(xué)、準(zhǔn)確地表征或預(yù)測微生物的群落結(jié)構(gòu)，樣本間差異性比較更具說服力[5]。

目前，利用高通量測序技術(shù)已經(jīng)對五糧液、瀘州老窖、古井貢酒、中周羌稞養(yǎng)生酒以及古襄陽酒等酒業(yè)窖池中窖泥的微生物群落進(jìn)行了不同程度的解析[2，6-9]。河南是中華酒的發(fā)源地，豫酒在經(jīng)歷了10年漫長的低谷期后，2017年，省委省政府將豫酒振興列為全省產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級攻堅工作之一。振興豫酒品質(zhì)先行，白酒品質(zhì)是發(fā)展根基，窖泥是濃香型白酒生產(chǎn)的關(guān)鍵，但是針對河南省濃香型白酒窖泥的研究非常薄弱。宋河酒業(yè)是濃香型豫酒代表，但目前對其窖泥微生物的研究還限于傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)以及局部窖泥的微生物變化規(guī)律探討[10-11]。因此，本研究以宋河濃香型白酒不同窖齡窖泥為研究對象，采用高通量測序技術(shù)對不同窖齡的窖泥、同一窖池不同部位窖泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行全面分析，同時對窖泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與窖泥理化指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行典范對應(yīng)分析（canonical correspondence analysis，CCA），探討影響其群落結(jié)構(gòu)的環(huán)境因素，為最終實(shí)現(xiàn)微生物菌群改造提升白酒品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

6年窖齡的窖壁泥（W1）和窖底泥（W2）、16年窖齡的窖壁泥（Y1）和窖底泥（Y2）樣品均采自河南宋河酒業(yè)股份有限責(zé)任公司白酒生產(chǎn)窖池。采用五點(diǎn)取樣法采集窖底泥（四角及窖底中心），距窖口約50 cm處采集窖壁泥（四壁中心），樣品充分混勻后迅速裝入無菌采樣袋，低溫帶回實(shí)驗(yàn)室，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

E.Z.N.A.Soil脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：美國OMEGA公司；TaqDNA聚合酶（5U/μL）：寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖（生化試劑）：西班牙Biowest Agarose公司；MagicPure磁珠核酸純化試劑盒：北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物341F和805R：生工生物工程（上海）股份有限公司；Qubit3.0 DNA檢測試劑盒：美國Life公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HQd水質(zhì)分析儀：美國HACH公司；IlluminaMiseqPE250高通量測序儀：美國Illumina公司；T100 Thermal Cycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國BIORAD公司；Qubit3.0熒光定量儀：美國Thermo Fisher公司；GelDoc-ItTS3凝膠成像系統(tǒng)：美國UVP公司；FE28/S210K pH計：瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 窖泥理化特性分析

對窖泥樣品的理化指標(biāo)（水分、有機(jī)物含量、有效磷含量、pH值以及氨基酸態(tài)氮含量）進(jìn)行測定。水分的測定：新鮮窖泥于105℃烘干2 h，測定烘干前后質(zhì)量差，計算得到樣本水分。有機(jī)物含量的測定：采用重鉻酸鉀容量法[12]。有效磷含量的測定：采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗分光光度法[13]進(jìn)行測定。pH值的測定：采用電位法進(jìn)行測定[14]。氨基酸態(tài)氮含量的測定：取1.0 g窖泥樣品于50 mL 0.1 mol/L KCl中，振蕩浸提30 min，過濾，采用靛酚蘭比色法測定[15]。

1.3.2 窖泥總DNA的提取

采用E.Z.N.A.Soil DNA提取試劑盒提取窖泥樣品中微生物的基因組DNA，于-20℃保存。

1.3.3 PCR擴(kuò)增及Illumina MiSeq測序

以基因組DNA為模板，采用引物341F和805R對細(xì)菌16S rDNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：2×Taq master Mix 15 μL，DNA模板10 ng，10 μmol/L正反向引物各1 μL，雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)充至30 μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，45℃退火30 s，72℃延伸30 s，共5個循環(huán)；然后95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共20個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測后，采用MagicPure磁珠核酸純化試劑盒對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化、回收，利用Qubit3.0DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，所有DNA樣本等量混合后，依托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測序。

1.3.4 高通量測序數(shù)據(jù)分析

采用Usearch軟件剔除測序結(jié)果中的嵌合序列，以97%序列相似性標(biāo)準(zhǔn)劃分操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），調(diào)用Mothur軟件，計算各個樣品覆蓋率（Coverage）和辛普森（Simpson）指數(shù)、香農(nóng)（Shannon）指數(shù)等多樣性指數(shù)及ACE、Chao1豐富度指數(shù)。

1.3.5 典范對應(yīng)分析

利用Canoco Windows 4.5軟件對窖泥細(xì)菌群落特性與環(huán)境因子的相關(guān)性進(jìn)行典范對應(yīng)分析。WCanoImp軟件將OTUs與環(huán)境因子數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為Canoco識別格式，經(jīng)Canoco Windows 4.5軟件運(yùn)算后利用Canodraw for Windows作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 窖泥理化指標(biāo)分析

窖泥的理化指標(biāo)檢測結(jié)果見表1。由表1可知，隨著窖齡的增加，窖泥的pH值、水分、氨基酸態(tài)氮、有效磷以及有機(jī)物含量均呈現(xiàn)增長的趨勢。窖泥養(yǎng)分的組成是窖泥質(zhì)量的重要標(biāo)志，也是微生物生長繁殖的重要基質(zhì)，其在不同程度上影響窖泥微生物群落的組成、分布及菌群演變。

表1 窖泥樣品的理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical indexes of pit mud samples

2.2高通量測序結(jié)果及Alpha多樣性分析

利用Illumina Miseq測序平臺得到窖泥樣品W1、W2、Y1、Y2的原始序列數(shù)分別為44 842條、48 003條、48 750條和55 762條。使用Usearch剔除嵌合序列，并與silva數(shù)據(jù)庫代表性序列進(jìn)行Blast比對，覆蓋率低于60%，相似度低于70%的序列被認(rèn)為是靶區(qū)域外序列，剔除該部分序列后最終得到的有效序列數(shù)分別為40930條、43757條、38595條和50037條，其平均長度分別為427.59 bp、425.68 bp、407.99 bp和417.81 bp。

在97%序列相似性水平上劃分OTU，4個窖泥樣品共得到4 561個OTUs，對其進(jìn)行Alpha多樣性分析，結(jié)果見表2。由表2可知，4個窖泥樣品的覆蓋率均＞98%，表明試驗(yàn)的取樣合理，測序結(jié)果能真實(shí)反映樣本的實(shí)際情況。窖泥樣品Y2的香農(nóng)指數(shù)（3.51）最高，辛普森指數(shù)（0.09）最低，說明其細(xì)菌群落的多樣性最高；窖泥樣品W2的ACE指數(shù)（2 876.21）及Chao1指數(shù)（2 293.38）最高，說明其細(xì)菌群落物種的豐富度最大，同時發(fā)現(xiàn)無論多樣性還是豐富度，窖泥樣品Y2高于Y1，W2高于W1。由此可見，窖齡越長的窖泥微生物多樣性越高，相同窖齡的窖底泥微生物多樣性及豐富度高于窖壁泥。這與DING X F等[16-17]的研究結(jié)果相一致。

表2 窖泥樣品細(xì)菌的序列數(shù)、OTU數(shù)及Alpha多樣性指數(shù)Table 2 Sequence number,operational taxonomic unit number and Alpha diversity index of bacteria in pit mud samples

基于窖泥樣品中細(xì)菌的香農(nóng)指數(shù)繪制稀釋性曲線，結(jié)果見圖1。由圖1可知，4個窖泥樣品的稀釋性曲線趨向平坦，進(jìn)一步說明本次測序數(shù)據(jù)量合理[17]。

圖1 基于香農(nóng)指數(shù)不同窖泥樣品的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of different pit mud samples based on Shannon index

2.3 基于屬水平窖泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

依據(jù)高通量測序獲得的序列信息，在屬水平上分析窖泥細(xì)菌的種類和相對豐度。根據(jù)相對豐度將樣本中的菌屬分為優(yōu)勢菌屬（相對豐度≥1.0%）和次要菌屬（相對豐度＜1.0%），且將次要菌屬歸類于其他（others），結(jié)果見圖2。

圖2 基于屬水平窖泥中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Analysis of bacterial community structure of pit mud based on genus level

由圖2可知，6年窖池窖泥細(xì)菌群落多樣性較低，窖底泥與窖壁泥中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性不大，均以厚壁菌門（Firmicutes）的乳酸菌屬（Lactobacillus）為絕對優(yōu)勢細(xì)菌屬，相對豐度分別為96.09%和78.35%。16年窖池窖泥細(xì)菌群落多樣性愈加豐富，細(xì)菌主要?dú)w屬于厚壁菌門（Firmicutes）、互養(yǎng)菌門（Synergistetes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）3個門類。16年窖壁泥與窖底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在屬水平上差異顯著，窖壁泥與窖底泥共有的絕對優(yōu)勢細(xì)菌屬主要為梭菌屬（Clostridium）、氨基酸桿菌（Aminobacterium）、理研菌屬（Petrimonas）、互營單胞菌屬（Syntrophomonas）和消化鏈球菌屬（Sedimentibacter）。兩者特有絕對優(yōu)勢細(xì)菌屬共7種，其中乳酸菌屬的變化最明顯，16年窖底泥中其相對豐度高達(dá)50.66%，為絕對優(yōu)勢細(xì)菌屬，而在窖壁泥中其相對豐度僅為0.35%，為次要細(xì)菌屬。與6年窖池窖泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相比，16年窖池窖泥乳酸菌屬相對豐度顯著降低，梭菌屬和氨基酸桿菌增長迅速，其相對豐度在窖壁泥、窖底泥中分別為49.01%、9.98%和12.84%、20.05%。HUX等[18]應(yīng)用Illumina Miseq技術(shù)對江蘇湯溝濃香型白酒優(yōu)質(zhì)、普通和退化窖泥中細(xì)菌多樣性進(jìn)行了分析，研究發(fā)現(xiàn)隨著窖泥質(zhì)量的提升，乳酸菌屬含量顯著減少，而梭菌屬、氨基酸桿菌等核心屬的含量明顯增加；羅雯等[19]借助高通量測序技術(shù)探討了四川某知名濃香型白酒生產(chǎn)廠不同性狀窖泥的微生物群落結(jié)構(gòu)組成，研究同樣發(fā)現(xiàn)趨老熟、老熟窖泥中梭菌屬優(yōu)勢較為明顯。結(jié)果表明，本研究中的16年窖池已經(jīng)成為趨于老熟化的優(yōu)質(zhì)窖池，利用微生物群落組成預(yù)測窖泥質(zhì)量具有一定可行性。

2.4 典范對應(yīng)分析

采用Canoco for Windows 4.5軟件對4種窖泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與理化指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行典范對應(yīng)分析，結(jié)果見圖3。由圖3可知，窖泥樣品W1、W2均位于第三象限，說明6年窖底泥、窖壁泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有較高相似度。胡曉龍[20]研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)質(zhì)窖泥處于較高pH值、氨基酸態(tài)氮及有效磷環(huán)境中，本實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)，16年優(yōu)質(zhì)窖泥與上述3個理化指標(biāo)呈現(xiàn)正相關(guān)性。且5個理化指標(biāo)中，pH值與有機(jī)物含量分別是影響窖泥樣品Y1、Y2的主要理化指標(biāo)。因此，根據(jù)典范對應(yīng)分析結(jié)果推測，窖池窖泥的pH值和有機(jī)物含量可能是導(dǎo)致16年窖池窖泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化的外因。

圖3 窖泥細(xì)菌群落與理化指標(biāo)的典范對應(yīng)分析Fig.3 Canonical correspondence analysis of bacterial community and physicochemical indexes of pit mud

3 結(jié)論

本研究運(yùn)用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)較為全面的分析了河南宋河濃香型白酒不同窖齡窖泥、同一窖池不同部位窖泥的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征及其影響因素。結(jié)果表明，窖齡越長窖泥細(xì)菌群落多樣性越高，且相同窖齡、同一窖池的窖壁泥的細(xì)菌多樣性小于窖底泥。6年窖壁泥與窖底泥的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似，絕對優(yōu)勢細(xì)菌屬均為Lactobacillus。16年窖壁泥與窖底泥的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大，共有的絕對優(yōu)勢細(xì)菌屬為Clostridium、Aminobacterium、Petrimonas、Syntrophomonas和Sedimentibacter。特有細(xì)菌屬中Lactobacillus相對豐度的降低以及Clostridium和Aminobacterium相對豐度的迅速增長，均表明16年窖池已成為趨于老熟化的優(yōu)質(zhì)窖池。CCA分析結(jié)果推測，pH值和有機(jī)物含量可能是影響16年窖壁泥與窖底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)不同的主要環(huán)境因子。