張楓源，代珍珠，向 福，2*，李俊賢，謝 實(shí)

（1.黃岡師范學(xué)院 經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃岡 438000；2.大別山特色資源開(kāi)發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 黃岡 438000）

金銀花（Lonicerae japonica Thunb）是隸屬于忍冬科植物的干燥花蕾，被譽(yù)為“國(guó)寶一枝花”，其有效成分主要為綠原酸等有機(jī)酸類(lèi)化合物、木犀草苷等黃酮類(lèi)化合物，以及揮發(fā)油、三萜類(lèi)化合物等活性物質(zhì)[1]，在臨床上能起到解毒、抗炎、降血脂、調(diào)節(jié)免疫等作用[2]。

羅田縣位于湖北省東北部，地處大別山，氣候環(huán)境適宜，山地丘陵隨處可見(jiàn)野生金銀花，具有很好的金銀花資源開(kāi)發(fā)潛能[3]?！傲_田金銀花”由于具有濃郁的香氣和較高含量的綠原酸等活性成分，被評(píng)為“中國(guó)地理標(biāo)志產(chǎn)品”[4-5]?！傲_田金銀花”從2011年開(kāi)始大面積種植，目前種植規(guī)模已超過(guò)2萬(wàn)畝，加速了羅田縣金銀花露加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。金銀花露加工過(guò)程中產(chǎn)生大量的蒸餾殘液，其中雖然含有綠原酸等金銀花的主要活性物質(zhì)[6]，但由于深加工不足，本地企業(yè)多是直接排放，不僅造成巨大的資源浪費(fèi)，也對(duì)環(huán)境造成污染。

綠原酸是一種酚類(lèi)化合物，易溶于水、醇、丙酮等[7]，是植物體在有氧呼吸過(guò)程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類(lèi)化合物，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、降血壓、降血脂、抗輻射、提高白細(xì)胞數(shù)量、補(bǔ)腎、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)等能力[8-12]。生物轉(zhuǎn)化又稱(chēng)為生物催化，是依據(jù)各種選擇性催化生成相應(yīng)的產(chǎn)物[13]，其中涉及到糖基化、環(huán)氧化、水解等一系列反應(yīng)[14-15]。微生物轉(zhuǎn)化植物次生代謝產(chǎn)物近年來(lái)逐漸受到人們關(guān)注[16]，特別是在中藥活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化合成方面表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[17-19]。目前對(duì)綠原酸轉(zhuǎn)化的研究多是篩選內(nèi)生真菌來(lái)提高其產(chǎn)量或利用微生物對(duì)其進(jìn)行分解[20-22]，有關(guān)菌株轉(zhuǎn)化金銀花中綠原酸的研究較少。

本文擬通過(guò)篩選轉(zhuǎn)化綠原酸的優(yōu)勢(shì)菌株，探討其用于發(fā)酵轉(zhuǎn)化金銀花蒸餾殘液中綠原酸的優(yōu)化條件，從而為地方金銀花露加工企業(yè)提供一種簡(jiǎn)單有效的蒸餾剩余物資源化利用工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金銀花蒸餾殘液：湖北楚天舒藥業(yè)有限公司蒸餾剩余物過(guò)濾后制得備用；黑曲霉（Aspergillus niger）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）：本校微生物實(shí)驗(yàn)室。

氯化鈉（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；酵母抽提物、蛋白胨（生化試劑）：天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)。

察氏培養(yǎng)基[23]：取蔗糖30 g，瓊脂20 g，NaNO33.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，K2HPO41.0 g，KCl 0.5g，蒸餾水1L，pH自然。

1.2 儀器與設(shè)備

HYG-B型全溫度搖瓶柜：太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠(chǎng)；YX280/15壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫(yī)療器械有限公司；Ax-205 METTLERTOLEDO型電子天平：瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)；精密試紙：上海三愛(ài)思試劑有限公司；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；H/T18MM型臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南赫西儀器裝備有限公司；Varian Cary100Scan型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：美國(guó)Varian公司；SB25-12DTDN型超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制及樣品中綠原酸含量計(jì)算

根據(jù)文獻(xiàn)[24]，準(zhǔn)確稱(chēng)量6.20 mg綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，反滲透水定容到100 mL容量瓶中，搖勻備用。用移液槍吸取0、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液于10 mL容量瓶?jī)?nèi)，以不加綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的一組作為對(duì)照，掃描確定最大吸收波長(zhǎng)為320 nm，以吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，綠原酸質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，得到綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為A=58.721C-0.119 9，R2=0.999 4，表明綠原酸在0.006 2～0.0310mg/mL范圍內(nèi)的質(zhì)量濃度與吸光度值呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系。

按上述方法在波長(zhǎng)320 nm處測(cè)定樣液的吸光度值，并計(jì)算綠原酸質(zhì)量濃度，利用公式（1）計(jì)算綠原酸增量：

其中，E為綠原酸增量，μg/mL；C樣液為三個(gè)平行試驗(yàn)發(fā)酵液樣品中綠原酸質(zhì)量濃度，mg/mL；C母液為三個(gè)平行樣品所對(duì)應(yīng)的未經(jīng)菌液發(fā)酵的混合液中綠原酸質(zhì)量濃度，mg/mL；V為液體發(fā)酵液的體積，mL。

1.3.2 菌株的篩選

實(shí)驗(yàn)選取的菌種分別為枯草芽孢桿菌和黑曲霉，將菌擴(kuò)大培養(yǎng)（細(xì)菌培養(yǎng)16～18 h，黑曲霉培養(yǎng)3 d），將培養(yǎng)的菌按1∶2（V∶V）的比例加入滅完菌的含有察氏培養(yǎng)基和金銀花蒸餾剩余物的錐形瓶中，做三個(gè)平行組以及一個(gè)對(duì)照組，再將其放入搖床30℃、150 r/min條件下培養(yǎng)6 h，培養(yǎng)結(jié)束后，將其取出高速離心，取上清液，測(cè)定吸光度值，計(jì)算綠原酸含量。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

總加入體積為150 mL，取培養(yǎng)基30 mL于250 mL三角瓶，剩余120 mL按一定接種量繼續(xù)加入，分別以發(fā)酵溫度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）、發(fā)酵時(shí)間（4h、6h、8h、10h、24 h）、接種量（0.58×107CFU/mL、0.72×107CFU/mL、0.96×107CFU/mL、1.44×107CFU/mL、1.92×107CFU/mL）、搖床轉(zhuǎn)速（0、50 r/min、100 r/min、150 r/min和200 r/min）為變量，考察各因素對(duì)金銀花蒸餾殘液中綠原酸含量的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn)

選取發(fā)酵時(shí)間（A）、接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）和轉(zhuǎn)速（D）四個(gè)單因素，設(shè)計(jì)如表1所示的L9（34）正交試驗(yàn)，優(yōu)化發(fā)酵轉(zhuǎn)化金銀花蒸餾剩余物中綠原酸的工藝。

表1 生物轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for biotrans formation conditions optimization

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2003和正交設(shè)計(jì)助手等軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

兩種菌株轉(zhuǎn)化綠原酸結(jié)果如表2所示，兩種菌株都能增加金銀花蒸餾剩余物中綠原酸含量，其中以枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)，綠原酸含量增加135.33 μg/mL，顯著高于黑曲霉的轉(zhuǎn)化能力（P＜0.05）。因此，轉(zhuǎn)化菌株宜選枯草芽孢桿菌。

表2 兩種菌種對(duì)綠原酸含量的影響Table 2 Effect of two strains on chlorogenic acid content

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 發(fā)酵溫度對(duì)綠原酸增量的影響

發(fā)酵溫度是影響菌體生長(zhǎng)發(fā)育、代謝最直接的因素，考察發(fā)酵溫度對(duì)綠原酸增量的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，當(dāng)發(fā)酵溫度20℃增加至30℃時(shí)，綠原酸增量增加到峰值，其后隨著發(fā)酵的溫度上升，增量顯著降低（P＜0.05）?？赡苁菧囟瘸^(guò)30℃后，不適宜枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)和代謝而影響菌株的活性[25]，代謝和轉(zhuǎn)化綠原酸的能力隨之減弱。因此，發(fā)酵溫度以30℃為宜。

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)綠原酸增量的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on chlorogenic acid increment

2.2.2發(fā)酵時(shí)間對(duì)綠原酸增量的影響

考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)綠原酸增量的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，發(fā)酵4～6 h時(shí)，綠原酸的增量升高，延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間到8 h，綠原酸增量急劇下降。原因可能是隨著菌體的生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷的消耗，產(chǎn)生了較多的代謝物質(zhì)，抑制菌株的生長(zhǎng)代謝。因此，發(fā)酵時(shí)間以6 h為宜。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)綠原酸增量的影響Fig.2 Effect of fermentation time on chlorogenic acid increment

2.2.3接種量對(duì)綠原酸增量的影響

考察接種量對(duì)綠原酸增量的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，隨著接種量的減小，金銀花蒸餾剩余物中的綠原酸增量呈先增加后減少的趨勢(shì)，在1.44×107CFU/mL時(shí)達(dá)到最大值，為（79.70±4.77）μg/mL，可能是由于接種量減少后，枯草芽孢桿菌菌液少，不能及時(shí)轉(zhuǎn)化綠原酸，反而被抑制而使綠原酸含量負(fù)增長(zhǎng)。故以接種量以1.44×107CFU/mL為宜。

圖3 接種量對(duì)綠原酸增量的影響Fig.3 Effect of inoculum on chlorogenic acid increment

2.3.4轉(zhuǎn)速對(duì)綠原酸增量的影響

枯草芽孢桿菌發(fā)酵受溶氧水平影響，考察轉(zhuǎn)速對(duì)綠原酸增量的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，隨著轉(zhuǎn)速的加快，金銀花蒸餾剩余物中的綠原酸增量不斷增大，直到轉(zhuǎn)速為150r/min時(shí)，增量增加到峰值。之后，隨著轉(zhuǎn)速的增加，綠原酸增量下降趨勢(shì)明顯。這是由于轉(zhuǎn)速加快，增大了溶氧量，使菌株的代謝能力增強(qiáng)，綠原酸增量隨之增加。超過(guò)150 r/min后，溶氧量雖然增大了，但是發(fā)酵液中的剪切力也與之增大，對(duì)菌株可能有損傷，影響生長(zhǎng)代謝。故選擇轉(zhuǎn)速150 r/min為宜。

圖4 轉(zhuǎn)速對(duì)綠原酸增量的影響Fig.4 Effect of rotating speed on chlorogenic acid increment

2.4 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

以發(fā)酵時(shí)間（A）、接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）和轉(zhuǎn)速（D）四個(gè)因素設(shè)計(jì)的L9（34）正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果和方差分析分別如表3和表4所示。

表3 生物轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for biotrans formation conditions optimization

續(xù)表

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

根據(jù)表3～表4的正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果，4個(gè)因素對(duì)枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化金銀花蒸餾殘液中綠原酸的影響程度為C＞A＞D＞B，即影響最大的因素為發(fā)酵溫度，其次為發(fā)酵時(shí)間，搖床轉(zhuǎn)速和接種量則影響相對(duì)較?。挥杀?可知，發(fā)酵轉(zhuǎn)化的優(yōu)化工藝為A3B2C1D2，即發(fā)酵溫度25℃，發(fā)酵時(shí)間8 h，轉(zhuǎn)速150 r/min，接種量1.44×107CFU/mL。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)優(yōu)化工藝條件，平行試驗(yàn)3次，綠原酸增量為（193.03±47.60）μg/mL，高于表3中綠原酸最高增量（191.67±39.25）μg/mL，表明正交試驗(yàn)所確定的優(yōu)化條件可作為枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化金銀花蒸餾剩余物中綠原酸的最佳工藝。

3 結(jié)論

以實(shí)驗(yàn)室的枯草芽孢桿菌作為優(yōu)勢(shì)菌株，可用于轉(zhuǎn)化提高地方企業(yè)金銀花露加工蒸餾剩余物中的綠原酸含量，其最佳發(fā)酵工藝為發(fā)酵溫度25℃，發(fā)酵時(shí)間8 h，轉(zhuǎn)速150 r/min，接種量1.44×107CFU/mL。此時(shí)，金銀花蒸餾剩余物中枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化綠原酸增量可達(dá)（193.03±47.60）μg/mL。該方法可用于工業(yè)化生產(chǎn)，從而為地方金銀花露加工企業(yè)提供了一種簡(jiǎn)單有效的蒸餾剩余物資源化利用工藝。