趙志軍，位 寧，劉延波，劉 寧，王洪彬，孫西玉，4，潘春梅*

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 食品與生物工程學院（酒業(yè)學院），河南 鄭州 450046；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 河南省白酒風格工程技術研究中心，河南 鄭州 450046；3.賒店老酒股份有限公司，河南 南陽 473300；4.河南張弓老酒酒業(yè)有限公司，河南 商丘 476733）

濃香型白酒產(chǎn)銷量在各香型中位居首位，其產(chǎn)量和質量深度影響著我國白酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]。濃香型白酒以泥窖池為發(fā)酵容器，窖泥的質量直接影響白酒品質的優(yōu)劣[2-4]。窖泥中的微生物種類豐富，是釀制濃香型白酒的基礎[5]。酯化型微生物是窖泥中一類重要的功能菌[6]。在發(fā)酵過程中，酯化菌代謝產(chǎn)生的酯化酶使乙醇與己酸、乙酸、乳酸等有機酸縮合，生成己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯等酯類，構成濃香型白酒的主體香成分[7]。

在窖泥中，可以產(chǎn)生酯化酶的微生物種類繁多，有酵母菌、霉菌、細菌等[8]。由于窖泥中高醇、高酸、微氧的極端條件，導致其中真菌含量較少[9]。因此，窖泥中的酯化型微生物以細菌為主[10-11]。目前，關于窖泥中酯類物質的研究以香氣物質及其前體物的產(chǎn)生菌為主，關于窖泥中酯化型細菌的研究與應用有一些報道[12-15]。本研究基于酯化菌在白酒香氣成分中的突出作用，立足于賒店老酒的優(yōu)質窖泥，分離篩選出高產(chǎn)酯化酶的細菌，利用分子生物學手段對其進行鑒定，并在單因素試驗基礎上采用響應面法對其發(fā)酵產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化。擬將所得到的高酯化力細菌制備成酯化菌液，投入窖池，為生產(chǎn)優(yōu)質濃香型白酒奠定理論及實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

窖泥：賒店老酒股份有限公司。

1.1.2 化學試劑

三丁酸甘油酯（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；環(huán)己烷（分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；正己酸（分析純）：天津市光復精細化工研究所；無水乙醇、葡萄糖（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技有限公司；2×EsTaq Master Mix：北京康為世紀生物有限公司；DL2000 Marker：北京博邁德生物技術公司；可溶性淀粉（生化試劑）：天津市恒興化學試劑制造有限公司；高粱粉（食品級）、玉米面（食品級）：河南省新鄉(xiāng)市原陽縣農(nóng)家自產(chǎn)；紅糖（食品級）：北京德眾嘉鑫經(jīng)貿(mào)有限公司；牛肉膏、蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；瓊脂粉（生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，121℃滅菌30 min。

初篩培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂粉20 g/L，加入三丁酸甘油酯1%，121℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏20.0 g/L，葡葡糖20.0 g/L，K2HPO41.0g/L，（NH）42SO41.0g/L，MgSO·47H2O1.0g/L，NaCl0.5g/L，F(xiàn)eSO·47H2O 0.01 g/L，調pH至7.0，121℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

H1850R離心機：湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司；ZQLY-300S恒溫培養(yǎng)搖床：上海精宏試驗設備有限公司；JA1003分析天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；DNP-9272BS電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；DYY-2C電泳儀：北京六一生物科技有限公司；D-37085聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國Senso Quest有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種分離純化

稱取5 g窖泥于45 mL無菌水中，充分振蕩，取上清液用無菌水逐級稀釋，得到10-2～10-3稀釋度的菌懸液。吸取上述菌懸液各100 μL，分別涂布于初篩培養(yǎng)基上，每個稀釋度做兩個平行。將涂布均勻的平板置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24～48 h，觀察在菌落周圍出現(xiàn)的透明圈，將產(chǎn)圈菌落于平板初篩培養(yǎng)基上劃線分離至純種。

1.3.2 菌種初篩

將分離出的菌株點植于初篩培養(yǎng)基中，每個菌株做三個平行，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察菌落周圍出現(xiàn)的透明圈，記錄透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）之比，選取D/d值較大者進行復篩。

1.3.3 菌種復篩

將初篩后的菌株接種于5 mL/25 mL液體培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min搖床培養(yǎng)19 h，取1 mL轉接于50 mL/250 mL液體培養(yǎng)基中，同樣條件下再次培養(yǎng)19 h，以5%的接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液經(jīng)10000r/min離心10min，取上清液于4℃保存，備用。

1.3.4 酯化酶活力的測定[12-13]

測定方法：于10 mL環(huán)己烷體系中加入正己酸和無水乙醇，己酸量為6.25 mL，無水乙醇與己酸體積比為1.0∶1.8（上述試劑每500 mL加入無水硫酸鈉30 g），并向其中加入0.2 mL酶液，于37℃條件下保溫酯化24 h。吸取上清0.5 mL于100mL三角瓶中，加入5mL蒸餾水，2滴酚酞，用0.05mol/L NaOH溶液滴定至終點，記錄消耗NaOH溶液體積。

酯化酶酶活力定義：在37℃條件下，每分鐘消耗1μmol己酸需要的酯化酶量為1個酶活力單位（U/mL）。

1.3.5 菌種鑒定

（1）形態(tài)學鑒定

將產(chǎn)酶活力較高的菌株于固體培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)24h，觀察菌落的大小、顏色、表面形態(tài)、質地、邊緣形狀和高度等并做記錄，菌株經(jīng)革蘭氏染色觀察細胞形態(tài)，經(jīng)孔雀綠染液染色觀察芽孢形態(tài)[16]。

（2）分子生物學鑒定

采用試劑盒法，提取菌株S2D27的基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），用細菌的通用引物（27F和1492R）對提取的DNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物送由上海生物工程有限公司進行測序。根據(jù)測序結果，選擇準確度較高的基因序列，從GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索有關種的公認16SrDNA標準序列數(shù)據(jù)進行比對，并使用MEGA6.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹[17]。

1.3.6 菌株培養(yǎng)基優(yōu)化

最適碳源及其最適碳源添加量的確定：分別以2%的葡萄糖、可溶性淀粉、高粱粉、紅糖、玉米面替代發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，其他成分不變。按5%的接種量，接入搖床培養(yǎng)19h的菌液，于30℃、150 r/min搖床培養(yǎng)48 h，測定酯化酶活力，優(yōu)選出最佳碳源。再分別調節(jié)最適碳源添加量為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%，同時測定酯化酶活力，以確定其最適碳源添加量。

最適氮源及其最適氮源添加量的確定：分別以2%的蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、豆粕、硝酸銨替代發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源，其他成分不變。接入5%的菌液，于30℃、150 r/min搖床培養(yǎng)48 h，測定酯化酶活力，優(yōu)選出最佳氮源。調節(jié)最佳氮源的添加量為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%，測定酯化酶活力以確定其最適氮源添加量[18]。

1.3.7 菌株發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

考察初始pH值（4、5、6、7、8）、接種量（3%、5%、7%、9%、11%）及培養(yǎng)時間（2d、3d、4d、5d、6d）對酯化酶活力的影響。

1.3.8 菌株發(fā)酵條件優(yōu)化響應面分析試驗[20]

使用Design-Expert軟件，在單因素試驗的基礎上，選取豆粕添加量（A）、培養(yǎng)基初始pH值（B）、培養(yǎng)時間（C）3個對產(chǎn)酶影響較大的因素為自變量，以酯化酶活力（Y）為響應值，進行響應面試驗，其試驗因素與水平見表1。

表1 產(chǎn)酶條件優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for enzyme producing conditions optimization

2 結果與分析

2.1 菌株篩選結果

2.1.1 菌株初篩

通過透明圈法對窖泥樣品進行初篩，得到10株透明圈較大的菌株，結果見表2。由表2可知，菌株S2D27的D/d值最大，為3.66；其他菌株的D/d值在2.14～3.66。

表2 菌株透明圈直徑與菌落直徑比值Table 2 Transparent circle diameter and colony diameter ratio of strains

2.1.2菌株復篩

選取初篩D/d值在2.50以上的菌株進行復篩，5株菌酯化酶活力大小測定結果見表3。由表3可知，菌株S2D27產(chǎn)酯化酶活力最高，可達10.43 U/mL，其他菌株產(chǎn)酯化酶活力在7.08～9.63 U/mL。因此，選擇菌株S2D27作為出發(fā)菌株，對其進行形態(tài)觀察、分子生物學鑒定及最適發(fā)酵條件的優(yōu)化。

表3 菌株酯化酶活力測定結果Table 3 Determination results of esterase activity of strain

2.2 菌株鑒定結果

2.2.1 形態(tài)學鑒定

菌株S2D27經(jīng)初篩培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，其菌落、細胞及芽孢形態(tài)見圖1。由圖1A可知，菌株S2D27產(chǎn)透明圈，菌落較小，表面皺褶，低凸起，菌落規(guī)則，無光澤，質地黏稠不易挑取，菌落周圍與邊緣顏色不一致，不透明。由圖1B可知，經(jīng)革蘭氏染色后，菌株形態(tài)呈短桿狀，顏色呈紫紅色，為革蘭氏陽性菌。由圖1C可知，經(jīng)孔雀綠染液染色后，菌株S2D27產(chǎn)芽孢，芽孢形態(tài)為橢圓形。

圖1 菌株S2D27的菌落（A）、細胞（B）及芽孢（C）形態(tài)Fig.1 Colony(A),cell(B)and spore(C)morphology of strain S2D27

2.2.2 分子生物學鑒定

圖2 菌株S2D27的16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of 16S rDNA PCR amplification products of strain S2D27

菌株S2D27的PCR擴增產(chǎn)物電泳分析結果見圖2。由圖2可知，菌株S2D27的16S rDNA序列堿基長度為1 480 bp左右，與預期結果相符。擴增產(chǎn)物送由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將測序結果于美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）上使用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）分析比對，發(fā)現(xiàn)菌株S2D27與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus berezoensis）同源性較高，達到99%。選取9株與菌株S2D27同源性較高的16SrDNA標準序列數(shù)據(jù)構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖3。由圖3可知，菌株S2D27與Bacillus berezoensis（MG234434.1）聚于同一支，因此，鑒定菌株S2D27為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus berezoensis）。

圖3 基于16S rDNA序列菌株S2D27的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain S2D27 based on 16S rDNA sequences

2.3 菌株S2D27發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.3.1 最適碳源及最適碳源添加量的確定

圖4 不同碳源對酯化酶酶活的影響Fig.4 Effect of different carbon sources on esterifying enzyme activity

由圖4可知，高粱粉作為碳源時，酯化酶酶活力最高，為16.44 U/mL，同時高粱粉營養(yǎng)豐富，廉價易得，更適合于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，選擇高粱粉作為最適碳源。

圖5 不同高粱粉添加量對酯化酶酶活的影響Fig.5 Effect of different sorghum flour addition on esterifying enzyme activity

由圖5可知，隨著高粱粉添加量在1.0%～2.0%范圍內(nèi)的升高，酯化酶酶活有一定程度的提高；當高粱粉添加量為2.0%時，酯化酶酶活最高，為13.43 U/mL；當高粱粉添加量＞2.0%之后，酯化酶酶活隨之下降。因此，選擇最佳高粱粉添加量為2.0%。

2.3.2 最適氮源及最適氮源添加量的確定

圖6 不同氮源對酯化酶酶活的影響Fig.6 Effect of different nitrogen sources on esterifying enzyme activity

由圖6可知，不同氮源種類對酯化酶酶活影響較小，豆粕作為氮源時，酯化酶酶活最高，為15.72 U/mL。因此，選擇豆粕作為最適氮源。

圖7 不同豆粕添加量對酯化酶酶活的影響Fig.7 Effect of different soybean meal addition on esterifying enzyme activity

由圖7可知，隨著豆粕添加量在1.0%～1.5%范圍內(nèi)的升高，酯化酶酶活隨之增加；在豆粕添加量為1.5%時，酯化酶酶活最高，為15.44U/mL；在豆粕添加量＞1.5%之后，酯化酶酶活隨之下降。因此，選擇最適豆粕添加量為1.5%。

2.4 菌株S2D27發(fā)酵條件優(yōu)化

2.4.1 最適初始pH值的確定

圖8 不同初始pH值對酯化酶酶活的影響Fig.8 Effect of different initial pH on esterifying enzyme activity

由圖8可知，酯化酶酶活隨培養(yǎng)基初始pH值的升高而升高，當初始pH值為5時，酯化酶酶活達到最大，為15.71U/mL。因此，選擇培養(yǎng)基的最適初始pH值為5。

2.4.2 最適接種量的確定

圖9 不同接種量對酯化酶酶活的影響Fig.9 Effect of different inoculum on esterifying enzyme activity

由圖9可知，當接種量＜5%之前，酯化酶酶活呈上升趨勢；當接種量為5%時，酯化酶酶活達到最大，為14.90 U/mL；當接種量＞5%之后，酯化酶酶活明顯下降。因此，選擇最適接種量為5%。

2.4.3 不同培養(yǎng)時間對菌株酶活的影響

圖10 不同培養(yǎng)時間對酯化酶酶活的影響Fig.10 Effect of different culture time on esterifying enzyme activity

由圖10可知，隨著培養(yǎng)時間在2～3 d范圍內(nèi)的延長，菌株酶活不斷升高；當培養(yǎng)時間為3 d時，酯化酶酶活最高，為16.04 U/mL；當培養(yǎng)時間＞3 d之后，酯化酶酶活隨之下降。因此，選擇最佳培養(yǎng)時間為3 d。

2.5 發(fā)酵條件優(yōu)化響應面試驗

2.5.1 回歸模型建立及方差分析

在單因素試驗的基礎上，選取豆粕添加量（A）、培養(yǎng)基初始pH值（B）、培養(yǎng)時間（C）三個對產(chǎn)酶影響較大的因素為自變量，以酯化酶酶活力（Y）為響應值，進行響應面試驗。試驗設計及結果見表4。

通過響應面分析軟件Design-Expert8.0.6對表4中的數(shù)據(jù)進行分析，得到數(shù)學模型，并對數(shù)學模型進行方差分析，得到模型和回歸系數(shù)的顯著性，結果見表5。對因素進行二次回歸擬合分析，建立顯著因素的擬合方程如下：

Y=17.14-0.55A-0.4B+0.90C-0.063AB+0.10AC+0.22BC-0.61A2-2.13B2-1.69C2

表4 產(chǎn)酶條件優(yōu)化響應面試驗設計及結果Table 4 Design and results of response surface tests for enzyme producing conditions optimization

表5 回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

由表5可知，模型的P值＜0.000 1，說明該模型顯著，失擬項P值=0.202 7＞0.05，不顯著，說明本試驗所得二次回歸方程擬合程度良好，能夠很好地對響應值進行預測。決定系數(shù)R2為0.994 1，調整決定系數(shù)R2adj為0.986 5，表明模型擬合程度良好，可以用來預測該菌株的酯化酶活力。由F值可以看出，3個因素對酯化酶活力影響的大小順序為：培養(yǎng)時間（C）＞豆粕添加量（A）＞培養(yǎng)基初始pH值（B）。

2.5.2 響應曲面分析

響應面模型直觀反映了各因素對酯化酶活力的交互影響，結果見圖11。

圖11 豆粕添加量、培養(yǎng)基初始pH值及培養(yǎng)時間對酯化酶酶活影響的響應面及等高線Fig.11 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between soybean meal addition,initial pH of medium and culture time on esterifying enzyme activity

由圖11可知，響應面越陡說明相關因素間交互作用越強。各因素大小從四周逐漸趨向中心點時，曲面呈凸起趨勢，說明存在最大響應值。運用Design-Expert8.0軟件對其結果進行分析，預測最佳發(fā)酵條件為豆粕添加量1.29%、培養(yǎng)基初始pH值4.93、培養(yǎng)時間3.25 d，酯化酶活力理論值為17.38 U/mL。

2.5.3 驗證試驗

考慮到實際操作的方便性，調整豆粕添加量為1.3%，培養(yǎng)時間為3 d和培養(yǎng)基初始pH值為5，進行3次平行驗證試驗，酯化酶活力為17.25 U/mL，與預測值17.38 U/mL基本吻合，說明該模型可靠性強。

3 結論

通過透明圈法從窖泥樣品中篩選得到一株酯化酶活力較高的菌株S2D27，經(jīng)分子生物學鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus berezoensis）。以此菌株為出發(fā)菌株，對其最適發(fā)酵條件進行了研究，在單因素試驗的基礎上，以豆粕添加量、培養(yǎng)基初始pH值及培養(yǎng)時間為自變量，以酯化酶活力為響應值，進行響應面試驗。結果表明，在豆粕添加量為1.3%、初始pH值為5，培養(yǎng)時間3 d條件下，菌株酯化酶活力可達17.25 U/mL，是優(yōu)化前的1.65倍。