鄭 潔，庹 利，2，李 偉，保玉心，2*

（1.遵義醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州 遵義 563006；2.遵義市理化分析測(cè)試工程研究中心，貴州 遵義 563006）

放線菌是原核生物中經(jīng)濟(jì)和生物學(xué)上最具有價(jià)值的細(xì)菌，可以產(chǎn)生各種生物活性物質(zhì)，如抗生素、抗腫瘤藥物以及生物酶等[1]。目前，放線菌已成為新型抗生素生產(chǎn)的主要來(lái)源之一，包括最重要的抗菌藥物，如β-內(nèi)酰胺、四環(huán)素、利福霉素、氨基糖苷、大環(huán)內(nèi)酯和糖肽[2]。因此，放線菌在天然化合物開(kāi)發(fā)方面具有至關(guān)重要的作用和潛力[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，已發(fā)現(xiàn)超過(guò)一半以上的天然活性物質(zhì)來(lái)自于放線菌[4]。然而，隨著抗生素的大規(guī)模使用，病原菌耐藥性逐漸增加，使得現(xiàn)有的抗生素越來(lái)越不足以應(yīng)對(duì)，因此迫切需要產(chǎn)生新的抗生素?，F(xiàn)代基因組研究成果表明，特殊生境可能蘊(yùn)藏著新物種，而新物種可能具有合成新化合物的基因，因此從特殊生境中發(fā)現(xiàn)放線菌資源是尋找新化合物的有效方法[5]。

由于溫泉的持續(xù)高溫環(huán)境條件及其獨(dú)特的物理化學(xué)特征，促進(jìn)了特殊微生物群的形成，因此在溫泉環(huán)境中，聚集了大量適合極端環(huán)境條件生存的微生物如嗜熱菌[6]。近年來(lái)，由于高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和宏基因組學(xué)方法的出現(xiàn)，國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始關(guān)注溫泉微生物群體的多樣性以及功能基因分析[7]。關(guān)于溫泉微生物多樣性以及篩選抗生素合成相關(guān)基因的研究具有良好的醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。RUCKMANI A等[8-9]分別研究印度高止山脈西部溫泉和哥倫比亞安迪斯山脈的El Coquito酸性溫泉中的微生物多樣性。肖凱等[10]研究廣東金山溫泉微生物的多樣性，發(fā)現(xiàn)菌株S-X2與嗜熱藍(lán)細(xì)菌聚球藻BP-1（47118315）具有高度的相似性。近年來(lái)，對(duì)于溫泉中放線菌的多樣性和抗生素合成基因篩選的研究很少。1991年，徐麗華等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在云南安寧溫泉次生林中共分離到放線菌8個(gè)種屬。王勇等[12]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)白山的不同環(huán)境以及溫泉中采集的土樣中分離出來(lái)的BOS-009菌株具有一定的抗植物病原菌作用。

山西省是我國(guó)的內(nèi)陸省份，也是地?zé)豳Y源豐富的地區(qū)，溫泉遍布全省，其中大多數(shù)溫泉集中分布在某一區(qū)域[13]。山西太子灘溫泉屬于地?zé)峋?，水溫達(dá)46.5℃。本研究以太子灘溫泉地?zé)峋車(chē)耐寥罉悠窞檠芯繉?duì)象，通過(guò)對(duì)土壤中的放線菌進(jìn)行分離鑒定并對(duì)其菌株進(jìn)行功能基因篩選，旨在探索放線菌新物種及其潛在活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 土壤樣品

2018年2月采集于太子灘溫泉泉眼周?chē)寥罉悠?份（編號(hào)：W1、W2、W3、W4），樣品采集信息如表1。

表1 采集的土壤樣品信息Table 1 Information of collected soil sample

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）分離培養(yǎng)基

高氏1號(hào)培養(yǎng)基（M1）：可溶性淀粉 20.0 g，KNO31 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，瓊脂20.0 g，加雙蒸水定容至1 L。

自來(lái)水酵母粉瓊脂培養(yǎng)基（M2）：酵母浸汁0.25 g，K2HPO40.5 g，瓊脂18.0 g，加雙蒸水定容至1 L。

葡萄糖酵母麥芽（glucose yeast malt extract，GYM）培養(yǎng)基（M3）：葡萄糖4.0 g，CaCO32.0 g，麥芽抽提物10.0 g，瓊脂粉15.0 g，酵母抽提物共4.0 g，加雙蒸水定容至1 L。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（M4）：牛肉膏5.0 g，氯化鈉5.0 g，蛋白胨10 g，瓊脂15.0 g，加雙蒸水定容至1 L。

LB培養(yǎng)基（M5）：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl0.5g，瓊脂15.0 g，加雙蒸水定容至1 L。

大豆酪蛋白瓊脂（tryptic soy agar，TSA）培養(yǎng)基（M6）：TSA30.0g，瓊脂20.0g，加雙蒸水定容至1L。

（2）純化培養(yǎng)基

鏈霉菌培養(yǎng)基二號(hào)ISP2培養(yǎng)基：葡萄糖4.0 g，酵母粉4.0 g，麥芽浸粉10.0 g，瓊脂20.0 g，加雙蒸水定容至1 L。

1.1.3 主要試劑

2×EasyTaq SuperMix、pEASY-T1 Cloning Kit、EasyPure Quick Gel Extraction Kit、Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞、DNAMarker、X-gal、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物27F和1492R，A3F和A7R，K1F和M6R，KSα和KSβ：上海生物工程股份有限公司；High Fidelity PCR Super Mix：北京全式金生物技術(shù)有限公司；Chelex-100樹(shù)脂，美國(guó)BioRad公司；瓊脂糖、TAE緩沖液：購(gòu)自北京索萊寶公司；萘啶酮酸（20 mg/L）、重鉻酸鉀（60 mg/L）[14]：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSC-1600IIA2生物安全柜：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ZXSD-B1270生化培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；SHKE481HP型落地式恒溫制冷搖床：美國(guó)Thermo公司；SX-500高壓蒸汽滅菌鍋：日本Tomy公司；Microfuge系列臺(tái)式微量離心機(jī)：美國(guó)Beckman公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymeras chain reaction，PCR）T100擴(kuò)增儀、Gel DocTMXR+凝膠成像儀：美國(guó)BioRad公司；DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理與菌株的稀釋平板分離

菌種分離前2周，取等量土壤樣品置于培養(yǎng)皿中，自然風(fēng)干。將風(fēng)干后的土壤研磨過(guò)篩后，每份樣品取2 g放入裝有18 mL無(wú)菌水的離心管中，28℃、180 r/min振蕩過(guò)夜。然后取樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋，使其終濃度為10-2和10-3。取終濃度為10-3樣品200μL涂布于上述分離培養(yǎng)基上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～8周。

1.3.2 菌株的純化及保藏

觀察分離培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和生長(zhǎng)狀況，并用肉眼判斷將放線菌菌落進(jìn)行編號(hào)。挑取單菌落于ISP2固體平板上，采用四區(qū)劃線法進(jìn)行純化，重復(fù)這一過(guò)程直至得到純培養(yǎng)物。同時(shí)，將生長(zhǎng)好的菌落置于20%甘油中-80℃保存。

1.3.3 基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

（1）16S rRNA基因測(cè)序和分析

按Chelex-100法進(jìn)行菌株DNA的提取[15]。PCR擴(kuò)增引物為通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）'和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）'。PCR反應(yīng)體系：2×EasyTaqSuperMix 25 μL，27F引物2 μL，1492R引物2 μL，模板2 μL，無(wú)菌水19 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃、5 min；94 ℃、1 min，55 ℃、1 min，72 ℃、2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將電泳檢測(cè)結(jié)果顯示為陽(yáng)性的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送交生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

（2）序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

測(cè)序獲得的16S rRNA基因序列利用EzBioCloud（http：//www.ezbiocloud.net）[16]數(shù)據(jù)庫(kù)中的EzTaxon在線比對(duì)服務(wù)進(jìn)行相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)菌株的相似性比對(duì)搜索，確定菌株的分類學(xué)地位，并從中調(diào)出相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)菌株的序列作為參比對(duì)象，用ClustalX[17]軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，采用MEGA 5.0[18]軟件以鄰接法（neighbor-joining，NJ）[19]進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，系統(tǒng)進(jìn)化矩陣根據(jù)Kimura-2-parameter模型估算，重復(fù)取樣1000次進(jìn)行自展值分析以評(píng)估進(jìn)化樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

1.3.4 抗生素生物合成基因的探測(cè)

放線菌基因組DNA的提取同1.3.3（1），以基因組DNA作為模板PCR擴(kuò)增非核糖體多肽合成酶（nonribosomal peptide synthetases，NRPS）基因A結(jié)構(gòu)域（引物A3F：5'-GCSTACSYSATSTACACSTCSGG-3'；A7F：5'-SASGTCVCCSGTSCGGTAS-3）'[20]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃、5min；95℃、0.5 min，59 ℃、2 min，72 ℃、4 min，35個(gè)循環(huán)；72℃、10min。擴(kuò)增I型聚酮合酶（I type polyketide synthase，PKSI）基因KS結(jié)構(gòu)域（引物K1F：5'-TSAAGTCSAACATCGGBCA-3'；M6R：5'-CGCAGGTTSCSGTACCAGTA-3）'[20]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃、5 min；95℃、0.5min，59℃、2min，72℃、4min，35個(gè)循環(huán)；72℃、10min。擴(kuò)增II型聚酮合酶（IItypepolyketide synthase，PKSII）基因KS結(jié)構(gòu)域（引物KSα：5'-TSGCSTGCTTGGAYGCSATC-3'；KSβ：5'-TGGAANCCGCCGAABCCTCT-3）'[15]，擴(kuò)增反應(yīng)條件：96℃、2min；96℃、1 min，60℃、2 min，73 ℃、1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃、8.5 min。PCR反應(yīng)體系都為50 μL，其中模板DNA 2 μL，A3F/A7R（10 μmol/L）、K1F/M6R（10 μmol/L）、KSα/KSβ（10 μmol/L）分別為2 μL，2TaqPCR Master Mix為25 μL，用ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，凝膠成像儀觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1菌種分離結(jié)果

使用6種分離培養(yǎng)基分離從曲沃太子灘溫泉周?chē)占?份土壤樣品中的放線菌。根據(jù)放線菌菌落形態(tài)初步篩選，選擇111株菌進(jìn)行16S rRNA基因序列擴(kuò)增和序列分析。結(jié)果表明，104株菌的16S rRNA基因序列比對(duì)結(jié)果是放線菌。4個(gè)樣品中，1號(hào)土壤樣品中分離到的放線菌數(shù)量最多，為34株，其次是3號(hào)土壤樣品，分離到放線菌27株。從不同培養(yǎng)基中分離的放線菌數(shù)量如表2所示。

表2 6種培養(yǎng)基分離放線菌的結(jié)果Table 2 Result of actinomycetes isolated by 6 media

由表2可知，在6種分離培養(yǎng)基中，從M2培養(yǎng)基中分離的放線菌數(shù)量最多，為24株，M1培養(yǎng)基分離的菌數(shù)最少。不同培養(yǎng)基中分離的菌株具有特殊性，植物桿菌屬（Plantibacter），紅球菌屬（Rhodococcas）為M2培養(yǎng)基所分離，原小單胞菌屬（Promicromonospora）為M3培養(yǎng)基所分離，壤霉菌屬（Agromyces）為M4培養(yǎng)基所分離，纖維菌屬（Cellulosimicrobium）為M5培養(yǎng)基所分離，（Pseudomonas）為M6培養(yǎng)基所分離。根據(jù)分離到的菌株數(shù)量及種屬數(shù)目，M2培養(yǎng)基和M6培養(yǎng)基的菌數(shù)量和種屬數(shù)目較多，可能較適合培養(yǎng)溫泉來(lái)源的放線菌。

2.2 土壤放線菌多樣性分析

104株菌的分布情況如表3所示，部分菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建結(jié)果見(jiàn)圖1。由表3可知，分離到的104株放線菌分布于3目、5科、12屬，分別是鏈霉菌科的鏈霉菌屬（Streptomyces）；微桿菌科的壤霉菌屬（Agromyces）、微桿菌屬（Microbacterium）、植物桿菌屬（Plantibacter）和短小桿菌屬（Curtobacterium）。微球菌科的Pseudarthrobacter屬、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）和Paenarthrobacter屬；原小單胞菌科的原小單胞菌屬（Promicromonospora）和纖維菌屬（Cellulosimicrobium）；Nocardio科的類諾卡氏菌屬（Nocardioides）和紅球菌屬（Rhodococcus）。其中，鏈霉菌76株，占所分離菌株的73.07%，屬優(yōu)勢(shì)種；微球菌科最具多樣化，包括6株微桿菌屬、5株壤霉菌屬、2株植物桿菌屬和1株短小桿菌屬。就放線菌的多樣性而言，從太子灘溫泉附近的土壤中所獲得的稀有放線菌和種屬數(shù)量相對(duì)較高，多樣性較好。

表3 104株放線菌的多樣性分布情況Table 3 Diversity and distribution of 104 actinomycetes

圖1 基于16S rRNA序列構(gòu)建的部分菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of partial strains based on 16S rRNA gene sequences

2.3 土壤放線菌新穎性分析

以98.65%作為區(qū)分兩個(gè)原核物種的“金標(biāo)準(zhǔn)”[21]，即菌株16S rRNA基因序列最大相似率低于98.65%的視為潛在新物種，對(duì)山西太子灘溫泉放線菌進(jìn)行新穎性分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的菌株M6W4-7-2的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strain M6W4-7-2 based on 16S rRNA gene sequences

由圖2可知，有一株菌的16SrRNA基因序列相似率低于98.65%，菌株編號(hào)為M6W4-7-2，其與最近發(fā)表菌株Streptomyces ruberNRRC 14600T（GenBank 登錄號(hào)：AB184604）的相似率為98.58%，在基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的NJ法系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，菌株M6W4-7-2在Streptomyces屬中形成單獨(dú)的一個(gè)分支。基于相似率和進(jìn)化樹(shù)分析，推測(cè)菌株M6W4-7-2可能為鏈霉菌科鏈霉菌屬的潛在新種，但是其確切的分類地位需要進(jìn)行形態(tài)特征分析、生理生化特性分析等分類工作來(lái)確定。

2.4 NRPS、PKS I和PKS II基因的篩選結(jié)果

放線菌的抗菌活性與其產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物密切相關(guān)，而微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物中的主要結(jié)構(gòu)是通過(guò)非核糖體多肽合成酶和聚酮合酶合成[22]。微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物是重要的藥物來(lái)源，但是傳統(tǒng)方法獲得活性次生代謝產(chǎn)物存在代謝量低，很難檢測(cè)及提純等諸多因素的限制[23]。近年來(lái)，隨著生物技術(shù)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，許多微生物活性次生代謝產(chǎn)物的生物合成機(jī)制已得到解釋。它為通過(guò)篩選功能基因預(yù)測(cè)微生物活性次生代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和類型提供了理論基礎(chǔ)[24]。從分離的放線菌菌株中隨機(jī)篩選出69株菌進(jìn)行NRPS、PKS I和PKS II生物合成基因的PCR篩選，結(jié)果如圖3所示，篩選電泳圖結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖3 NRPS、PKS I和PKS II基因的PCR篩選結(jié)果Fig.3 Screening results of genes from NRPS,PKS I and PKS II by PCR

其中，NRPS、PKS I以及PKS II基因PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別是在700～800 bp、1 200～1 400 bp和600 bp左右。48株放線菌含有至少一種生物合成基因，總陽(yáng)性率為69.5%。其中，含有PKS II基因的陽(yáng)性菌株數(shù)目與NRPS基因的陽(yáng)性菌株數(shù)均為27株，含有PKS I基因的放線菌有15株，5株同時(shí)含有三種生物合成基因。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，潛在新種菌株M6W4-7-2同時(shí)具有NRPS、PKS II兩種抗生素合成基因。因此，對(duì)該區(qū)域土壤樣品的采集以及對(duì)菌株M6W4-7-2活性次生代謝產(chǎn)物的分離與鑒定將是下一步研究工作的重點(diǎn)，以期發(fā)現(xiàn)該區(qū)域土壤中存在的潛在放線菌新種以及從菌株M6W4-7-2中獲得新穎的生物活性物質(zhì)，為放線菌次生代謝產(chǎn)物的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

圖4 NRPS基因（A）、PKS I基因（B）、PKS II基因（C）篩選電泳圖Fig.4 Electrophoregram of genes screening from NRPS(A)、PKS I(B)、PKS II(C)

3 結(jié)論

以山西太子灘溫泉周?chē)寥罉悠窞檠芯繉?duì)象，選用6種分離培養(yǎng)基對(duì)土壤中的放線菌進(jìn)行分離鑒定與抗生素合成基因的篩選。結(jié)果表明，4份土壤樣品中共分離得到104株放線菌，分布于放線菌域的3目、5科和12屬。隨機(jī)選取69株放線菌進(jìn)行功能基因篩選，有69.5%的放線菌具有至少一個(gè)生物合成基因簇，陽(yáng)性率較高。這說(shuō)明山西太子灘溫泉周?chē)寥乐蟹啪€菌具有豐富的多樣性和抗生素產(chǎn)生潛力，是后期放線菌分離方法研究的高質(zhì)量材料，能為尋找新活性新結(jié)構(gòu)化合物提供可能存在的潛力菌株。