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        山西太子灘溫泉土壤放線菌多樣性及功能基因篩選的研究

        2019-10-08 05:44:08保玉心
        中國(guó)釀造 2019年9期

        鄭 潔,庹 利,2,李 偉,保玉心,2*

        (1.遵義醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心,貴州 遵義 563006;2.遵義市理化分析測(cè)試工程研究中心,貴州 遵義 563006)

        放線菌是原核生物中經(jīng)濟(jì)和生物學(xué)上最具有價(jià)值的細(xì)菌,可以產(chǎn)生各種生物活性物質(zhì),如抗生素、抗腫瘤藥物以及生物酶等[1]。目前,放線菌已成為新型抗生素生產(chǎn)的主要來(lái)源之一,包括最重要的抗菌藥物,如β-內(nèi)酰胺、四環(huán)素、利福霉素、氨基糖苷、大環(huán)內(nèi)酯和糖肽[2]。因此,放線菌在天然化合物開(kāi)發(fā)方面具有至關(guān)重要的作用和潛力[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì),已發(fā)現(xiàn)超過(guò)一半以上的天然活性物質(zhì)來(lái)自于放線菌[4]。然而,隨著抗生素的大規(guī)模使用,病原菌耐藥性逐漸增加,使得現(xiàn)有的抗生素越來(lái)越不足以應(yīng)對(duì),因此迫切需要產(chǎn)生新的抗生素?,F(xiàn)代基因組研究成果表明,特殊生境可能蘊(yùn)藏著新物種,而新物種可能具有合成新化合物的基因,因此從特殊生境中發(fā)現(xiàn)放線菌資源是尋找新化合物的有效方法[5]。

        由于溫泉的持續(xù)高溫環(huán)境條件及其獨(dú)特的物理化學(xué)特征,促進(jìn)了特殊微生物群的形成,因此在溫泉環(huán)境中,聚集了大量適合極端環(huán)境條件生存的微生物如嗜熱菌[6]。近年來(lái),由于高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和宏基因組學(xué)方法的出現(xiàn),國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始關(guān)注溫泉微生物群體的多樣性以及功能基因分析[7]。關(guān)于溫泉微生物多樣性以及篩選抗生素合成相關(guān)基因的研究具有良好的醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。RUCKMANI A等[8-9]分別研究印度高止山脈西部溫泉和哥倫比亞安迪斯山脈的El Coquito酸性溫泉中的微生物多樣性。肖凱等[10]研究廣東金山溫泉微生物的多樣性,發(fā)現(xiàn)菌株S-X2與嗜熱藍(lán)細(xì)菌聚球藻BP-1(47118315)具有高度的相似性。近年來(lái),對(duì)于溫泉中放線菌的多樣性和抗生素合成基因篩選的研究很少。1991年,徐麗華等[11]研究發(fā)現(xiàn),在云南安寧溫泉次生林中共分離到放線菌8個(gè)種屬。王勇等[12]研究發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)白山的不同環(huán)境以及溫泉中采集的土樣中分離出來(lái)的BOS-009菌株具有一定的抗植物病原菌作用。

        山西省是我國(guó)的內(nèi)陸省份,也是地?zé)豳Y源豐富的地區(qū),溫泉遍布全省,其中大多數(shù)溫泉集中分布在某一區(qū)域[13]。山西太子灘溫泉屬于地?zé)峋?,水溫達(dá)46.5℃。本研究以太子灘溫泉地?zé)峋車(chē)耐寥罉悠窞檠芯繉?duì)象,通過(guò)對(duì)土壤中的放線菌進(jìn)行分離鑒定并對(duì)其菌株進(jìn)行功能基因篩選,旨在探索放線菌新物種及其潛在活性。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        1.1.1 土壤樣品

        2018年2月采集于太子灘溫泉泉眼周?chē)寥罉悠?份(編號(hào):W1、W2、W3、W4),樣品采集信息如表1。

        表1 采集的土壤樣品信息Table 1 Information of collected soil sample

        1.1.2 培養(yǎng)基

        (1)分離培養(yǎng)基

        高氏1號(hào)培養(yǎng)基(M1):可溶性淀粉 20.0 g,KNO31 g,NaCl 0.5 g,K2HPO40.5 g,MgSO40.5 g,F(xiàn)eSO40.01 g,瓊脂20.0 g,加雙蒸水定容至1 L。

        自來(lái)水酵母粉瓊脂培養(yǎng)基(M2):酵母浸汁0.25 g,K2HPO40.5 g,瓊脂18.0 g,加雙蒸水定容至1 L。

        葡萄糖酵母麥芽(glucose yeast malt extract,GYM)培養(yǎng)基(M3):葡萄糖4.0 g,CaCO32.0 g,麥芽抽提物10.0 g,瓊脂粉15.0 g,酵母抽提物共4.0 g,加雙蒸水定容至1 L。

        牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(M4):牛肉膏5.0 g,氯化鈉5.0 g,蛋白胨10 g,瓊脂15.0 g,加雙蒸水定容至1 L。

        LB培養(yǎng)基(M5):蛋白胨10.0g,酵母粉5.0g,NaCl0.5g,瓊脂15.0 g,加雙蒸水定容至1 L。

        大豆酪蛋白瓊脂(tryptic soy agar,TSA)培養(yǎng)基(M6):TSA30.0g,瓊脂20.0g,加雙蒸水定容至1L。

        (2)純化培養(yǎng)基

        鏈霉菌培養(yǎng)基二號(hào)ISP2培養(yǎng)基:葡萄糖4.0 g,酵母粉4.0 g,麥芽浸粉10.0 g,瓊脂20.0 g,加雙蒸水定容至1 L。

        1.1.3 主要試劑

        2×EasyTaq SuperMix、pEASY-T1 Cloning Kit、EasyPure Quick Gel Extraction Kit、Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞、DNAMarker、X-gal、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)引物27F和1492R,A3F和A7R,K1F和M6R,KSα和KSβ:上海生物工程股份有限公司;High Fidelity PCR Super Mix:北京全式金生物技術(shù)有限公司;Chelex-100樹(shù)脂,美國(guó)BioRad公司;瓊脂糖、TAE緩沖液:購(gòu)自北京索萊寶公司;萘啶酮酸(20 mg/L)、重鉻酸鉀(60 mg/L)[14]:上海麥克林生化科技有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        BSC-1600IIA2生物安全柜:蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;ZXSD-B1270生化培養(yǎng)箱:上海智城分析儀器制造有限公司;SHKE481HP型落地式恒溫制冷搖床:美國(guó)Thermo公司;SX-500高壓蒸汽滅菌鍋:日本Tomy公司;Microfuge系列臺(tái)式微量離心機(jī):美國(guó)Beckman公司;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymeras chain reaction,PCR)T100擴(kuò)增儀、Gel DocTMXR+凝膠成像儀:美國(guó)BioRad公司;DYY-6C型電泳儀:北京市六一儀器廠。

        1.3 方法

        1.3.1 樣品處理與菌株的稀釋平板分離

        菌種分離前2周,取等量土壤樣品置于培養(yǎng)皿中,自然風(fēng)干。將風(fēng)干后的土壤研磨過(guò)篩后,每份樣品取2 g放入裝有18 mL無(wú)菌水的離心管中,28℃、180 r/min振蕩過(guò)夜。然后取樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋,使其終濃度為10-2和10-3。取終濃度為10-3樣品200μL涂布于上述分離培養(yǎng)基上,倒置放于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4~8周。

        1.3.2 菌株的純化及保藏

        觀察分離培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和生長(zhǎng)狀況,并用肉眼判斷將放線菌菌落進(jìn)行編號(hào)。挑取單菌落于ISP2固體平板上,采用四區(qū)劃線法進(jìn)行純化,重復(fù)這一過(guò)程直至得到純培養(yǎng)物。同時(shí),將生長(zhǎng)好的菌落置于20%甘油中-80℃保存。

        1.3.3 基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

        (1)16S rRNA基因測(cè)序和分析

        按Chelex-100法進(jìn)行菌株DNA的提取[15]。PCR擴(kuò)增引物為通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)'和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)'。PCR反應(yīng)體系:2×EasyTaqSuperMix 25 μL,27F引物2 μL,1492R引物2 μL,模板2 μL,無(wú)菌水19 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃、5 min;94 ℃、1 min,55 ℃、1 min,72 ℃、2 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃、10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),將電泳檢測(cè)結(jié)果顯示為陽(yáng)性的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送交生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

        (2)序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

        測(cè)序獲得的16S rRNA基因序列利用EzBioCloud(http://www.ezbiocloud.net)[16]數(shù)據(jù)庫(kù)中的EzTaxon在線比對(duì)服務(wù)進(jìn)行相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)菌株的相似性比對(duì)搜索,確定菌株的分類學(xué)地位,并從中調(diào)出相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)菌株的序列作為參比對(duì)象,用ClustalX[17]軟件進(jìn)行多序列比對(duì),采用MEGA 5.0[18]軟件以鄰接法(neighbor-joining,NJ)[19]進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),系統(tǒng)進(jìn)化矩陣根據(jù)Kimura-2-parameter模型估算,重復(fù)取樣1000次進(jìn)行自展值分析以評(píng)估進(jìn)化樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

        1.3.4 抗生素生物合成基因的探測(cè)

        放線菌基因組DNA的提取同1.3.3(1),以基因組DNA作為模板PCR擴(kuò)增非核糖體多肽合成酶(nonribosomal peptide synthetases,NRPS)基因A結(jié)構(gòu)域(引物A3F:5'-GCSTACSYSATSTACACSTCSGG-3';A7F:5'-SASGTCVCCSGTSCGGTAS-3)'[20]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:95℃、5min;95℃、0.5 min,59 ℃、2 min,72 ℃、4 min,35個(gè)循環(huán);72℃、10min。擴(kuò)增I型聚酮合酶(I type polyketide synthase,PKSI)基因KS結(jié)構(gòu)域(引物K1F:5'-TSAAGTCSAACATCGGBCA-3';M6R:5'-CGCAGGTTSCSGTACCAGTA-3)'[20]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:95℃、5 min;95℃、0.5min,59℃、2min,72℃、4min,35個(gè)循環(huán);72℃、10min。擴(kuò)增II型聚酮合酶(IItypepolyketide synthase,PKSII)基因KS結(jié)構(gòu)域(引物KSα:5'-TSGCSTGCTTGGAYGCSATC-3';KSβ:5'-TGGAANCCGCCGAABCCTCT-3)'[15],擴(kuò)增反應(yīng)條件:96℃、2min;96℃、1 min,60℃、2 min,73 ℃、1.5 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃、8.5 min。PCR反應(yīng)體系都為50 μL,其中模板DNA 2 μL,A3F/A7R(10 μmol/L)、K1F/M6R(10 μmol/L)、KSα/KSβ(10 μmol/L)分別為2 μL,2TaqPCR Master Mix為25 μL,用ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),凝膠成像儀觀察結(jié)果。

        2 結(jié)果與分析

        2.1菌種分離結(jié)果

        使用6種分離培養(yǎng)基分離從曲沃太子灘溫泉周?chē)占?份土壤樣品中的放線菌。根據(jù)放線菌菌落形態(tài)初步篩選,選擇111株菌進(jìn)行16S rRNA基因序列擴(kuò)增和序列分析。結(jié)果表明,104株菌的16S rRNA基因序列比對(duì)結(jié)果是放線菌。4個(gè)樣品中,1號(hào)土壤樣品中分離到的放線菌數(shù)量最多,為34株,其次是3號(hào)土壤樣品,分離到放線菌27株。從不同培養(yǎng)基中分離的放線菌數(shù)量如表2所示。

        表2 6種培養(yǎng)基分離放線菌的結(jié)果Table 2 Result of actinomycetes isolated by 6 media

        由表2可知,在6種分離培養(yǎng)基中,從M2培養(yǎng)基中分離的放線菌數(shù)量最多,為24株,M1培養(yǎng)基分離的菌數(shù)最少。不同培養(yǎng)基中分離的菌株具有特殊性,植物桿菌屬(Plantibacter),紅球菌屬(Rhodococcas)為M2培養(yǎng)基所分離,原小單胞菌屬(Promicromonospora)為M3培養(yǎng)基所分離,壤霉菌屬(Agromyces)為M4培養(yǎng)基所分離,纖維菌屬(Cellulosimicrobium)為M5培養(yǎng)基所分離,(Pseudomonas)為M6培養(yǎng)基所分離。根據(jù)分離到的菌株數(shù)量及種屬數(shù)目,M2培養(yǎng)基和M6培養(yǎng)基的菌數(shù)量和種屬數(shù)目較多,可能較適合培養(yǎng)溫泉來(lái)源的放線菌。

        2.2 土壤放線菌多樣性分析

        104株菌的分布情況如表3所示,部分菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建結(jié)果見(jiàn)圖1。由表3可知,分離到的104株放線菌分布于3目、5科、12屬,分別是鏈霉菌科的鏈霉菌屬(Streptomyces);微桿菌科的壤霉菌屬(Agromyces)、微桿菌屬(Microbacterium)、植物桿菌屬(Plantibacter)和短小桿菌屬(Curtobacterium)。微球菌科的Pseudarthrobacter屬、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)和Paenarthrobacter屬;原小單胞菌科的原小單胞菌屬(Promicromonospora)和纖維菌屬(Cellulosimicrobium);Nocardio科的類諾卡氏菌屬(Nocardioides)和紅球菌屬(Rhodococcus)。其中,鏈霉菌76株,占所分離菌株的73.07%,屬優(yōu)勢(shì)種;微球菌科最具多樣化,包括6株微桿菌屬、5株壤霉菌屬、2株植物桿菌屬和1株短小桿菌屬。就放線菌的多樣性而言,從太子灘溫泉附近的土壤中所獲得的稀有放線菌和種屬數(shù)量相對(duì)較高,多樣性較好。

        表3 104株放線菌的多樣性分布情況Table 3 Diversity and distribution of 104 actinomycetes

        圖1 基于16S rRNA序列構(gòu)建的部分菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of partial strains based on 16S rRNA gene sequences

        2.3 土壤放線菌新穎性分析

        以98.65%作為區(qū)分兩個(gè)原核物種的“金標(biāo)準(zhǔn)”[21],即菌株16S rRNA基因序列最大相似率低于98.65%的視為潛在新物種,對(duì)山西太子灘溫泉放線菌進(jìn)行新穎性分析,結(jié)果見(jiàn)圖2。

        圖2 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的菌株M6W4-7-2的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strain M6W4-7-2 based on 16S rRNA gene sequences

        由圖2可知,有一株菌的16SrRNA基因序列相似率低于98.65%,菌株編號(hào)為M6W4-7-2,其與最近發(fā)表菌株Streptomyces ruberNRRC 14600T(GenBank 登錄號(hào):AB184604)的相似率為98.58%,在基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的NJ法系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中,菌株M6W4-7-2在Streptomyces屬中形成單獨(dú)的一個(gè)分支。基于相似率和進(jìn)化樹(shù)分析,推測(cè)菌株M6W4-7-2可能為鏈霉菌科鏈霉菌屬的潛在新種,但是其確切的分類地位需要進(jìn)行形態(tài)特征分析、生理生化特性分析等分類工作來(lái)確定。

        2.4 NRPS、PKS I和PKS II基因的篩選結(jié)果

        放線菌的抗菌活性與其產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物密切相關(guān),而微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物中的主要結(jié)構(gòu)是通過(guò)非核糖體多肽合成酶和聚酮合酶合成[22]。微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物是重要的藥物來(lái)源,但是傳統(tǒng)方法獲得活性次生代謝產(chǎn)物存在代謝量低,很難檢測(cè)及提純等諸多因素的限制[23]。近年來(lái),隨著生物技術(shù)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展,許多微生物活性次生代謝產(chǎn)物的生物合成機(jī)制已得到解釋。它為通過(guò)篩選功能基因預(yù)測(cè)微生物活性次生代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和類型提供了理論基礎(chǔ)[24]。從分離的放線菌菌株中隨機(jī)篩選出69株菌進(jìn)行NRPS、PKS I和PKS II生物合成基因的PCR篩選,結(jié)果如圖3所示,篩選電泳圖結(jié)果見(jiàn)圖4。

        圖3 NRPS、PKS I和PKS II基因的PCR篩選結(jié)果Fig.3 Screening results of genes from NRPS,PKS I and PKS II by PCR

        其中,NRPS、PKS I以及PKS II基因PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別是在700~800 bp、1 200~1 400 bp和600 bp左右。48株放線菌含有至少一種生物合成基因,總陽(yáng)性率為69.5%。其中,含有PKS II基因的陽(yáng)性菌株數(shù)目與NRPS基因的陽(yáng)性菌株數(shù)均為27株,含有PKS I基因的放線菌有15株,5株同時(shí)含有三種生物合成基因。同時(shí)還發(fā)現(xiàn),潛在新種菌株M6W4-7-2同時(shí)具有NRPS、PKS II兩種抗生素合成基因。因此,對(duì)該區(qū)域土壤樣品的采集以及對(duì)菌株M6W4-7-2活性次生代謝產(chǎn)物的分離與鑒定將是下一步研究工作的重點(diǎn),以期發(fā)現(xiàn)該區(qū)域土壤中存在的潛在放線菌新種以及從菌株M6W4-7-2中獲得新穎的生物活性物質(zhì),為放線菌次生代謝產(chǎn)物的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

        圖4 NRPS基因(A)、PKS I基因(B)、PKS II基因(C)篩選電泳圖Fig.4 Electrophoregram of genes screening from NRPS(A)、PKS I(B)、PKS II(C)

        3 結(jié)論

        以山西太子灘溫泉周?chē)寥罉悠窞檠芯繉?duì)象,選用6種分離培養(yǎng)基對(duì)土壤中的放線菌進(jìn)行分離鑒定與抗生素合成基因的篩選。結(jié)果表明,4份土壤樣品中共分離得到104株放線菌,分布于放線菌域的3目、5科和12屬。隨機(jī)選取69株放線菌進(jìn)行功能基因篩選,有69.5%的放線菌具有至少一個(gè)生物合成基因簇,陽(yáng)性率較高。這說(shuō)明山西太子灘溫泉周?chē)寥乐蟹啪€菌具有豐富的多樣性和抗生素產(chǎn)生潛力,是后期放線菌分離方法研究的高質(zhì)量材料,能為尋找新活性新結(jié)構(gòu)化合物提供可能存在的潛力菌株。

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