牛天嬌，陳歷水，孔杭如，郭永杰，馬 鶯

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 化工與化學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.蒙牛高科乳制品（北京）有限公司，北京 101100；3.中糧營養(yǎng)健康研究院，北京 102209）

生物胺是一類含氮的低分子質(zhì)量活性有機化合物，主要由特殊的生物胺脫羧酶通過轉(zhuǎn)化特定的氨基酸形成對應(yīng)的生物胺[1]。適量的生物胺有助于人體正常的生理功能，而過量的生物胺則會導(dǎo)致中毒，引起頭痛、血壓變化、嘔吐等一系列嚴(yán)重反應(yīng)[2]。它是影響發(fā)酵肉制品安全性的重要因素之一，目前生產(chǎn)上多采用低溫儲藏、超高壓處理[3-5]和使用食品添加劑[6-7]等方法控制生物胺。這些方法能夠在一定程度上減少產(chǎn)品中的生物胺含量，但不能降解已經(jīng)產(chǎn)生的生物胺，且可能會抑制微生物的生長，因此不適用于發(fā)酵香腸的生產(chǎn)[8]。由此可見，找到有效的生物胺控制方法迫在眉睫。相比之下，利用發(fā)酵劑來控制發(fā)酵肉制品中的生物胺含量具有非常大的應(yīng)用潛力，其中能夠產(chǎn)生胺氧化酶的發(fā)酵劑因具有可以降解產(chǎn)品中已有的生物胺的優(yōu)勢而成為近年來的研究熱點。有研究發(fā)現(xiàn)使用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）進(jìn)行發(fā)酵時，生物胺的濃度下降了24%[9-10]，并且添加植物乳桿菌的劑量對總生物胺的產(chǎn)量影響更大[7，11]。ERKKILA S等[12]對發(fā)酵香腸的研究表明，游離氨基酸的含量是發(fā)酵過程中生物胺形成的限制性因素。TOSUKHOWONG A等[13]報道，植物乳桿菌可以顯著降低泰國發(fā)酵香腸中尸胺、腐胺、酪胺和組胺的含量。SUN Q X等[14]研究了植物乳桿菌對哈爾濱香腸的影響作用，結(jié)果表明植物乳桿菌可對尸胺、腐胺、色胺、2-苯乙胺、組胺和酪胺等生物胺起到抑制作用，且與其他乳桿菌混合后起到更強的抑制效果。CAPOZZI V等[15]研究表明，26株植物乳桿菌可降解葡萄酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的生物胺，其可作為乳酸發(fā)酵劑。ZHANG Q L等[16]探討了植物乳桿菌ZY-40對鰱魚香腸發(fā)酵過程中生物胺的降解作用，研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌ZY-40可降低70%以上的腐胺和尸胺，且可增加游離氨基酸的含量。

本研究對65株來源于傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品的耐鹽、耐亞硝酸鹽的乳酸菌，利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法進(jìn)行產(chǎn)生物胺定性定量檢測，篩選出降解率最高的不產(chǎn)生物胺菌株。經(jīng)形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性研究，并結(jié)合16S rDNA序列分析對其進(jìn)行鑒定，同時探索其作為發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸中生物胺含量的影響作用，從而為發(fā)酵肉制品發(fā)酵劑的篩選、生產(chǎn)質(zhì)量安全控制、營養(yǎng)功能提升提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

臘腸：分別購于成都、長沙、北京和昆明菜市場；發(fā)酵肉用發(fā)酵劑、商業(yè)用木糖葡糖球菌（Staphylococcus xylosus）：科漢森（北京）貿(mào)易有限公司；豬肉：市售。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏10.0 g/L，葡萄糖20.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，檸檬酸氫二銨2.0g/L，無水乙酸鈉5.0 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，吐溫80 0.1%，MgSO·47H2O 0.58 g/L，MnSO·44H2O 0.25 g/L。加熱煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH值到6.8，121℃高壓滅菌15 min。

MRS固體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1.5%瓊脂，121℃高壓滅菌15 min。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，調(diào)節(jié)pH值至7.4，121℃高壓滅菌15 min。

甘油培養(yǎng)基：脫脂乳12.0 g，水90 mL，甘油30 mL（約36 g），121 ℃滅菌15 min。

雙層顯色上層培養(yǎng)基：溴甲酚紫0.06 g，瓊脂20.0 g，1 000 mL蒸餾水，pH 5.2。121℃滅菌10 min。

雙層顯色下層培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g，酵母膏5.0 g，牛肉膏5.0g，NaCl2.5g，葡萄糖 0.5g，吐溫801mL，MgSO40.4 g，MnSO40.03 g，K2HPO42.0 g，檸檬酸三銨 2.0 g，CaCO30.1 g，F(xiàn)eSO40.04 g，VB10.01 g，磷酸吡哆醛0.05 g，瓊脂18.0 g。色氨酸、精氨酸、賴氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸各5.0 g，1 000 mL蒸餾水，pH 5.2。115℃高壓滅菌15 min。

1.1.3 化學(xué)試劑

葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨、牛肉膏（均為生化試劑）：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；色胺、酪胺、腐胺、苯乙胺、尸胺、組胺、精胺、亞精胺、乙腈、丹磺酰氯（dansyl chloride，DNS-Cl）（均為色譜純）：美國Sigma公司；磷酸氫二鉀、MnSO·44H2O、NaCl、NaOH、NaNO2、高氯酸（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；KOD-Plus高保真脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶：日本Toyobo公司；DNA凝膠回收試劑盒：北京博大泰克生物技術(shù)有限責(zé)任公司；PMD 19-T Vector Cloning試劑盒、Taq酶（5 U/μL）及Buffer：寶生物工程（大連）有限公司；生化鑒定用反應(yīng)管：杭州天和生物有限公司；API 20 E腸桿菌試劑條：法國梅里埃公司。

1.2 儀器與設(shè)備

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：日本TaKaRa公司；Lambda 25 UV/VIS spectrometer型分光光度計：美國Perkin Elmer公司；3K30型低溫高速離心機：德國Satorious公司；SPX-250-C恒溫培養(yǎng)箱：上?，槴\實驗設(shè)備有限公司；微孔過濾膜（0.22 μm）：濟(jì)南賽暢科學(xué)儀器有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀：日本島津有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵肉中細(xì)菌的分離和不產(chǎn)生物胺菌株的篩選

稱取4種市售發(fā)酵肉制品產(chǎn)品樣品各10 g，分別加入90 mL無菌生理鹽水，4℃渦旋振蕩（200 r/min）1 min，離心、取上清備用。選擇3個合適的梯度10-5、10-6、10-7，取10-7稀釋溶液通過稀釋倒平板法分別接種于含有6%NaCl、100 mg/kg NaNO2的MRS固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)24 h。挑取不同菌落形態(tài)、大小、顏色、生長位置的單菌落，以平板劃線反復(fù)分離純化，直至得到單菌落，將純化后的單菌落進(jìn)行培養(yǎng)保藏在甘油培養(yǎng)基中，每個菌株保藏3管，放置于-20℃，備用。將上述得到的菌株取一接種環(huán)接種到雙層顯色下層培養(yǎng)基上，37℃靜置培養(yǎng)48 h后，無菌條件下，在下層培養(yǎng)基上倒上一層上層培養(yǎng)基（50℃）顯色，并在5 min內(nèi)記錄實驗結(jié)果，顯紫色的為陽性（產(chǎn)胺菌），不變色即黃色為陰性（不產(chǎn)胺菌），以不接種菌株的培養(yǎng)基作為空白對照。選取陰性菌株作為實驗菌株。

1.3.2 菌株生物胺降解能力評價

（1）菌液制備

將篩選出的不產(chǎn)胺菌株分別以107CFU/g的濃度接入到含50 mg/L 8種生物胺的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)48 h后，將菌液與等體積0.4 mol/L高氯酸混合，于-20℃冰箱中保存、待測，以不接種菌株的MRS液體培養(yǎng)基作為空白對照。

（2）柱前衍生

取上述樣品菌液和空白對照各1mL，分別先加入2mol/L NaOH溶液200 μL，再加入300 μL飽和NaHCO3溶液進(jìn)行緩沖，然后再加入2 mLDNS-Cl溶液（含10 mg/mL丙酮），40℃水浴暗反應(yīng)45 min，加入100 μL NH3·H2O終止反應(yīng)，去除殘留的DNS-Cl溶液。用乙腈定容到5 mL，過0.22 μm有機濾膜后裝入棕色液相樣品瓶待測。

（3）生物胺含量測定

準(zhǔn)確稱取色胺、酪胺、腐胺、2-苯乙胺、尸胺、組胺、精胺、亞精胺各50mg，分別用0.4mol/L的高氯酸定容至50mL，并稀釋成質(zhì)量濃度分別為5 μg/mL、10 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，柱前衍生后（方法同上），利用高效液相色譜進(jìn)行測定，以生物胺含量（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制8種生物胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程對樣品中生物胺含量進(jìn)行定量分析。

高效液相色譜條件：AgilentC18柱（5μm，4.6mm×250mm）；流動相A為超純水，流動相B為乙腈；流速0.9 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；柱溫30℃；檢測波長254 nm。梯度洗脫程序見表1。

表1 生物胺分析的梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution programs for biogenic amines analysis

1.3.3菌株的鑒定

（1）菌株的活化

取一接種環(huán)植物乳桿菌PL-ZL001接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行下一代活化，連續(xù)活化3代，備用。

（2）菌株的生理生化和形態(tài)學(xué)鑒定

對分離得到的菌株進(jìn)行生理生化鑒定和形態(tài)學(xué)鑒定，鑒定標(biāo)準(zhǔn)參考《常見細(xì)菌鑒定手冊》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》。

生長曲線測定：將活化后的菌種接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，每2 h用分光光度計在波長600 nm處測定菌液的吸光度值（OD600nm）值，記錄數(shù)據(jù)繪制生長曲線。以MRS培養(yǎng)基為空白對照。

pH變化曲線測定：將篩選得到的菌種接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h，每2 h用酸度計測定pH值，記錄數(shù)據(jù)繪制pH值變化曲線。

（3）菌株的分子生物學(xué)鑒定

16SrDNA的分析采用菌落PCR方法進(jìn)行擴增。16SrDNA序列擴增的引物為：

正向引物為F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；反向引物為R：5'-AAGGAGGTGW TCCARCC-3'。

PCR反應(yīng)體系：10×Taqbuffer 5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）2.5 mmol/L 4 μL，MgCl（225 mmol/L）2.5 μL，PCR引物各5 μL，Taqplus DNA polymerase 2 μL，加滅菌雙蒸水補至50 μL。

PCR反應(yīng)條件為：94℃、3min；94℃、1min，54℃、1min，72℃、1 min，30個循環(huán)：72 ℃、5 min。

PCR產(chǎn)物與PMD19-T載體（TaKaRa）按PMD19-TVector Cloning試劑盒說明書進(jìn)行連接，鑒定正確后，送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序。將測序結(jié)果提交至美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology informa tion，NCBI），用基本局部比對搜索工具（basiclocalalignment search tool，BLAST）工具與GenBank中的16S rDNA序列進(jìn)行同源性分析并利用MEGA 4軟件中的鄰接（neighborjoining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 發(fā)酵香腸中生物胺的測定

（1）發(fā)酵香腸制作工藝

取豬后腿瘦肉80%、豬背脊20%進(jìn)行絞碎、腌制、斬拌之后加入發(fā)酵劑和添加劑（鹽2.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、蔗糖0.5%，葡萄糖0.5%，亞硝酸鈉0.015%，硝酸鉀0.02%，抗壞血酸0.05%）灌腸，在22～25℃，相對濕度90%～95%條件下發(fā)酵3 d，然后轉(zhuǎn)入10～13℃，相對濕度70%～80%環(huán)境下成熟25 d，得發(fā)酵香腸。

（2）發(fā)酵香腸生物胺含量測定

取5g發(fā)酵香腸樣品，與20 mL0.4 mol/L的高氯酸混勻，冷凍離心10 min（4℃、4 000 r/min），將上清液倒入50 mL容量瓶中，將沉淀部分重復(fù)上述操作，上清液再次倒入上述50 mL容量瓶中并用0.4 mol/L的高氯酸定容。按1.3.2方法，取1 mL樣液進(jìn)行柱前衍生，利用高效液相色譜對發(fā)酵香腸中的生物胺含量進(jìn)行測定，用氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線對發(fā)酵香腸中生物胺含量進(jìn)行定量分析。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均為3次以上實驗的平均值，采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（analysis of variance，ANOVA），并進(jìn)行顯著性比較，若P＜0.05，則差異顯著，若P＞0.05，則無顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不產(chǎn)生物胺菌株分離篩選

菌株產(chǎn)生的生物胺呈堿性，使培養(yǎng)基的pH值增加，指示劑溴甲酚紫從黃色變?yōu)樽仙?，而不產(chǎn)胺菌株培養(yǎng)基不變色。將從發(fā)酵肉制品中分離的菌株接種到雙層顯色下層培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，倒上一層上層培養(yǎng)基顯色。從中式發(fā)酵肉制品中篩選出的65株耐鹽耐亞硝酸鹽乳酸菌中，11株表現(xiàn)為陰性，即倒入上層培養(yǎng)基后不變色（呈黃色），為不產(chǎn)胺菌；54株菌表現(xiàn)為陽性，即倒入上層培養(yǎng)基后變?yōu)樽仙?，為產(chǎn)胺菌。選取11株不產(chǎn)胺菌（分別編號為1#～11#）為研究對象進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 菌株生物胺降解能力檢測

將篩選出的11株不產(chǎn)生物胺的乳酸菌進(jìn)行降解生物胺能力評價，結(jié)果見表2。由表2可知，11株不產(chǎn)生物胺的乳酸菌中大部分菌株能夠選擇性降解生物胺，菌株3#不具備降解生物胺的能力，菌株9#可降解8種生物胺，對色胺、尸胺的降解率分別達(dá)到了（65.64±5.21）%、（62.68±4.98）%，顯著高于其他菌株（P＜0.05），對苯乙胺、腐胺、組胺和亞精胺等生物胺的降解率也顯著高于其他菌株（P＜0.05）。因此，選擇菌株9#并將其重新編號為PL-ZL001，進(jìn)行后續(xù)實驗。

表2 菌株對生物胺降解能力的比較Table 2 Comparison of biogenic amines degradation ability of different strains

2.3 菌株的鑒定

2.3.1菌株的形態(tài)學(xué)、生理生化特性鑒定

挑單菌落將菌株P(guān)L-ZL001進(jìn)行培養(yǎng)，其菌落及細(xì)胞形態(tài)見圖1。由圖1A可知，菌落不透明，呈類圓形，邊緣整齊；由圖1B可知，菌體呈短桿狀，端圓。

圖1 菌株P(guān)L-ZL001的菌落（A）及細(xì)胞（B）形態(tài)Fig.1 Colony(A)and cell(B)morphology of strain PL-ZL001

菌株P(guān)L-ZL001具有耐中溫的特性，在最高溫度達(dá)42℃的條件下仍可生長，最適生長溫度為30～37℃。此外，該菌能在pH 4.0～10.0的范圍內(nèi)生長，最適生長pH為7.2，在0～10%NaCl的LB液體培養(yǎng)基均能生長，最適NaCl濃度為2%。利用法國梅里埃API鑒定系統(tǒng)對篩選菌株P(guān)L-ZL001進(jìn)行生理生化鑒定實驗，結(jié)果見表3。由表3可知，在糖類物質(zhì)中，D-海藻糖、D-蔗糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-龍膽二糖、D-松三糖、D-土倫糖和D-麥芽糖等均為陽性，D-阿拉伯糖、D-棉子糖、D-來蘇糖、D-塔格糖、D-巖藻糖、L-巖藻糖等均為陰性，鑒定百分率為99.0%，T值為0.5，初步鑒定該菌株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

表3 菌株P(guān)L-ZL001的生理生化鑒定實驗結(jié)果Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain PL-ZL001

續(xù)表

2.3.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

通過PCR擴增獲得菌株9#的16S rDNA序列，所測得到的序列長度為1 450 bp，測序結(jié)果良好，通過GenBank的序列登錄，將序列比較并構(gòu)建發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。由圖2可知，將該菌株的16S rDNA序列與NCBI BLAST中的核酸庫進(jìn)行比對，得到菌株P(guān)L-ZL001與植物乳桿菌CP011769.1在同一分支、距離最近，因此，菌株P(guān)L-ZL001被鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

圖2 基于16S rDNA序列菌株P(guān)L-ZL001的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain PL-ZL001 based on 16S rDNA sequences

2.4 菌株P(guān)L-ZL001生物胺降解驗證實驗結(jié)果

選取發(fā)酵肉制品中常用的木糖葡萄糖球菌與菌株P(guān)L-ZL001在發(fā)酵香腸中開展降解驗證實驗，以不添加菌種的樣品為空白對照進(jìn)行生物胺降解驗證實驗，生物胺含量測定結(jié)果見表4。

表4 添加不同發(fā)酵劑發(fā)酵香腸中生物胺含量的測定結(jié)果Table 4 Determination results of contents of biogenic amines in fermented sausages after adding different startersmg/kg

由表4可知，添加木糖葡糖球菌（Staphylococcusxylosus）與菌株P(guān)L-ZL001的產(chǎn)品中生物胺含量，除苯乙胺和亞精胺以外，含量均顯著降低（P＜0.05），降解率結(jié)果見表5。由表5可知，與空白對照組相比，添加植物乳桿菌PL-ZL001可顯著降低色胺、組胺、精胺等生物胺的含量（P＜0.05），降低幅度為10.92%～70.41%，其中以色胺降低幅度最大，為70.41%，這與之前的報道稱添加植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）能抑制色胺和苯乙胺的產(chǎn)生、降低發(fā)酵香腸中生物胺的含量等結(jié)論一致，其機制可能是通過改變脫羧酶的活性來降低香腸中生物胺的含量[16-20]。

表5 木糖葡糖球菌和植物乳桿菌在發(fā)酵香腸中生物胺降解率Table 5 Biogenic amine degradation rate of Staphyloccus xyloseand Lactobacillus plantarumin fermented sausages%

3 結(jié)論

本研究從發(fā)酵肉制品中篩選出65株耐鹽耐亞硝酸鹽的乳酸菌，對菌株的生物胺降解能力進(jìn)行定性、定量檢測，從中篩選出1株降解生物胺效率最高的菌株P(guān)L-ZL001。由形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性，并結(jié)合16SrDNA序列分析，鑒定菌株P(guān)L-ZL001屬于植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）。將其作為香腸發(fā)酵劑，對發(fā)酵香腸的生物胺含量進(jìn)行測定，結(jié)果表明，添加植物乳桿菌PL-ZL001可以抑制香腸中6種生物胺的積累，尤其是對毒性最大的組胺，控制效果最顯著（P＜0.05）。本研究為發(fā)酵肉制品中的發(fā)酵劑篩選、開發(fā)和發(fā)酵產(chǎn)品的營養(yǎng)功能提升提供了一定的理論依據(jù)。