王淑梅，張?zhí)m威*，張莉麗，張 爽，易華西

（1.哈爾濱學(xué)院 食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150086；2.中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266100；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

益生菌是生活在機(jī)體內(nèi)并且有益于宿主健康的一類活的微生物，通常指具有高選擇性的乳酸菌，其通過菌體細(xì)胞各組分發(fā)揮功能作用，如細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)、菌體肽聚糖和菌體脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）等[1-2]，其中最常見的是乳酸桿菌（Lactobacillus）和雙歧桿菌（Bifidobacterium）。目前，關(guān)于乳酸菌提高人體免疫功能[3]、抗腫瘤及抑菌作用[4-5]的研究已有相關(guān)報(bào)道。隨著對(duì)乳酸菌研究的不斷深入，各種功能性乳酸菌新品種相繼涌現(xiàn)。

目前，功能性乳酸菌的篩選方法主要有3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）。如采用MTT試驗(yàn)篩選具有抑制癌細(xì)胞增殖作用的菌株KFRI342細(xì)胞質(zhì)[6]；具有抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29細(xì)胞、Caco-2細(xì)胞和SW480細(xì)胞增殖作用的青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis）SPM0212丁醇提取物[7]；具有抑制人早幼粒急性白血病細(xì)胞HL-60生長(zhǎng)與增殖作用的植物乳桿菌（Lactococcus plantarum）培養(yǎng)上清液[8]；具有抑制胃癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞增殖作用的熱致死菌體細(xì)胞、細(xì)胞質(zhì)和菌體肽聚糖[9]。同樣，也有研究者采用MTT試驗(yàn)篩選出具有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系SNUC2A和胃癌細(xì)胞SNU-1增殖作用的乳酸乳球菌（Lactococcus lactisssp.lactis）細(xì)胞質(zhì)[10-11]，并通過形態(tài)學(xué)4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色和DNA損傷試驗(yàn)證實(shí)其可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞SNU-1的凋亡[12]。

課題組前期從中國西部傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離并篩選出4株具有潛在抗結(jié)腸癌功效的乳酸菌X11、X12、M5和K14[13]。本研究以這4株菌為研究對(duì)象，分離其細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)。首先通過MTT法初步篩選具有抑制HT-29細(xì)胞增殖能力的成分，再通過研究分離成分對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29細(xì)胞的DNA損傷、細(xì)胞凋亡及周期的影響，最終獲得具有抗結(jié)腸癌作用乳酸菌成分，為進(jìn)一步明確乳酸菌在抑制結(jié)腸癌過程中發(fā)揮的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及細(xì)胞

人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所；干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）X11、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei susbp.paracasei）X12：來源于新疆乳酪；L.caseiK14：來源于西藏酸乳酒；L.paracaseisubsp.paracasei M5：來源于新疆馬奶酒。以上乳酸菌保存于哈爾濱工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）GG ATCC 43121（LGG）：美國模式菌種收集中心（American type culture collection，ATCC）。

1.1.2 試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基、胰酶消化液、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：美國Corning公司；噻唑藍(lán)（MTT）：美國Sigma-Aldrich公司；Annexin V-FITC試劑盒、細(xì)胞DNA提取試劑盒：美國BD公司；胎牛血清：杭州四季青有限公司；PI染色液：北京Solarbio公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Universal Hood II凝膠成像系統(tǒng)、Bio-Rad-500酶標(biāo)儀：美國Bio-Rad公司；FACS Calibur流式細(xì)胞儀：美國R&D System公司；HEPA1100二氧化碳培養(yǎng)箱、ULT-1386-3-V超低溫冰箱：美國Thermo Electron公司；CX31電子顯微鏡：日本Olympus公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)

以菌株LGG為陽性對(duì)照，參照AMROUCHE T等[3-4]的方法分離4株乳酸菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)，并采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)含量[14]。

1.3.2 細(xì)胞毒性的檢測(cè)

首先采用MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定乳酸菌的細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)對(duì)HT-29細(xì)胞的抑制效果，具體方法如下：調(diào)整HT-29細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，取100 μL接種于96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞完全貼壁，加入乳酸菌X11、X12、M5和K14細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)，使各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)終質(zhì)量濃度為10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL[15]。將96孔培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2，95%空氣，100%濕度）中培養(yǎng)48h。當(dāng)培養(yǎng)44h時(shí)，加入10μLMTT，再繼續(xù)培養(yǎng)4h[16]，吸出液體，加入150 μL DMSO[17]。以只加RPMI 1640培養(yǎng)液的細(xì)胞為陰性對(duì)照，采用酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞在波長(zhǎng)490 nm處的吸光度值（OD490nm值）。計(jì)算乳酸菌細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)對(duì)HT-29細(xì)胞抑制率，其計(jì)算公式如下：

然后采用改良寇式法[9]計(jì)算細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)對(duì)HT-29細(xì)胞的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50），利用IC50值分析乳酸菌細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)對(duì)HT-29細(xì)胞的作用大小[18]。

1.3.3 乳酸菌細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)對(duì)HT-29細(xì)胞DNA損傷的檢測(cè)

調(diào)整HT-29細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL，加入6孔組織培養(yǎng)板中，每孔2 mL。待細(xì)胞完全貼壁后加入乳酸菌細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)，使其蛋白質(zhì)終含量為80 μg/mL，將6孔組織培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2，95%空氣，100%濕度）中培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗細(xì)胞，加入0.25%的胰酶和乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）混合液2mL，置于CO2培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2，95%空氣，100%濕度）中消化1～2 min。1 000×g離心5 min，收集細(xì)胞，再用預(yù)冷PBS溶液清洗細(xì)胞2次。采用細(xì)胞DNA提取試劑盒提取細(xì)胞DNA，采用1.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)[19]。

1.3.4 HT-29細(xì)胞凋亡及壞死檢測(cè)

采用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)HT-29細(xì)胞的凋亡及壞死情況[20-21]。

1.3.5 HT-29細(xì)胞周期的測(cè)定

采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析[22]。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，通過SAS 9.1軟件進(jìn)行方差分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（X±SD）的方式表示，顯著性水平設(shè)定為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

以牛血清蛋白質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，OD595nm值（Y）為縱坐標(biāo)繪制牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過線性擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=0.006 3X，相關(guān)系數(shù)R2=0.996，說明OD595nm值與牛血清蛋白質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好。乳酸菌細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)蛋白含量的測(cè)定結(jié)果見表1。

由表1可知，乳酸菌細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)含量為244.31～1 557.14 μg/mL，4株乳酸菌細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)含量與陽性對(duì)照LGG差異顯著（P＜0.05）。其中，副干酪乳桿菌M5細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞壁中的蛋白質(zhì)含量較高，分別為976.19 μg/mL，907.62 μg/mL；乳酸菌K14細(xì)胞壁中的蛋白質(zhì)含量（1 144.44 μg/mL）僅低于陽性對(duì)照組LGG細(xì)胞質(zhì)；而乳酸菌K14、X12、X11細(xì)胞質(zhì)中的蛋白含量均處于較低水平，分別為246.88 μg/mL、247.33 μg/mL、244.3 μg/mL。結(jié)果表明，同種菌屬不同菌株之間細(xì)胞成分中的蛋白質(zhì)含量不同。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行后續(xù)抑癌研究。

表1 乳酸菌細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)含量Table 1 Protein content in the cell wall and cytoplasm of lactic acid bacteria

2.2 乳酸菌細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)對(duì)HT-29細(xì)胞的毒性作用

表2 乳酸菌細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)對(duì)HT-29細(xì)胞的半抑制濃度值Table 2 Half maximal inhibitory concentration value of lactic acid bacteria cell wall and cytoplasm on HT-29 cells

由表2可知，乳酸菌M5和K14的細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)、乳酸菌X12和X11的細(xì)胞壁對(duì)HT-29細(xì)胞的IC50值均顯著低于陽性對(duì)照組LGG細(xì)胞壁（109.74 μg/mL）及細(xì)胞質(zhì)（102.32 μg/mL）（P＜0.05），其中，乳酸菌X11細(xì)胞壁對(duì)HT-29細(xì)胞的IC50值（55.31 μg/mL）最低，抑制效果最好。而乳酸菌X12和X11細(xì)胞質(zhì)對(duì)HT-29細(xì)胞的IC50值顯著高于陽性對(duì)照組LGG細(xì)胞質(zhì)，分別為135.25 μg/mL、124.80 μg/mL（P＜0.05），抑制效果最差。

2.3 乳酸菌細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)對(duì)HT-29細(xì)胞DNA的作用

由于含80 μg/mL蛋白質(zhì)的乳酸菌細(xì)胞壁或細(xì)胞質(zhì)持續(xù)作用于HT-29細(xì)胞48 h后，便可達(dá)到抑制HT-29細(xì)胞的作用，因此，本實(shí)驗(yàn)選用含80 μg/mL蛋白質(zhì)的細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)對(duì)HT-29細(xì)胞進(jìn)行處理。細(xì)胞DNA降解是細(xì)胞凋亡的晚期階段主要特征之一，在細(xì)胞凋亡后期，細(xì)胞DNA降解成小分子片段[23-24]，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)乳酸菌細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)對(duì)HT-29細(xì)胞DNA的作用，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，乳酸菌細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)持續(xù)作用于HT-29細(xì)胞48h后，細(xì)胞DNA出現(xiàn)彌散拖尾形態(tài)，但沒有產(chǎn)生明顯的DNA小分子片段。DNA損傷是細(xì)胞發(fā)生凋亡的一項(xiàng)重要標(biāo)志[21]，有研究顯示[22]，乳酸菌可通過誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞DNA損傷而實(shí)現(xiàn)其抗結(jié)腸癌功能，如嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）606可溶性胞外多糖通過誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞DNA損傷而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[23]。

圖1 乳酸菌細(xì)胞壁（a）及細(xì)胞質(zhì)（b）處理HT-29細(xì)胞后的DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis results of DNA of HT-29 cells after treated with lactic acid bacteria cell wall(a)and cytoplasm(b)

2.4 乳酸菌細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)對(duì)HT-29細(xì)胞的影響

表3 乳酸菌細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)對(duì)HT-29細(xì)胞的影響Table 3 Effect of lactic acid bacteria cell wall and cytoplasm on HT-29 cells

由表3可知，與陽性對(duì)照組LGG細(xì)胞壁相比，乳酸菌X12、K14細(xì)胞壁顯著促進(jìn)HT-29細(xì)胞的死亡（P＜0.05），使HT-29細(xì)胞早期凋亡細(xì)胞數(shù)分別提高72.38%、65.03%，壞死細(xì)胞數(shù)分別提高63.13%、1.69%，晚期凋亡細(xì)胞數(shù)分別提高127.18%、92.22%；乳酸菌M5細(xì)胞壁顯著促進(jìn)HT-29細(xì)胞的壞死及晚期凋亡（P＜0.05），使壞死細(xì)胞數(shù)提高65.59%，晚期凋亡細(xì)胞數(shù)提高137.14%。與陽性對(duì)照LGG細(xì)胞質(zhì)相比，乳酸菌M5細(xì)胞質(zhì)使HT-29細(xì)胞的早期凋亡細(xì)胞數(shù)提高96.16%，壞死細(xì)胞數(shù)提高7.31%，晚期凋亡細(xì)胞數(shù)提高20.08%。而乳酸菌X11細(xì)胞壁和K14細(xì)胞質(zhì)作用HT-29細(xì)胞48 h，早期凋亡、晚期凋亡和壞死細(xì)胞數(shù)均低于陽性對(duì)照組LGG。結(jié)果表明，乳酸菌X12、M5和K14細(xì)胞壁對(duì)HT-29細(xì)胞死亡具有顯著的誘導(dǎo)作用。為確認(rèn)乳酸菌X12、M5和K14細(xì)胞壁對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)，進(jìn)一步研究乳酸菌X12、M5和K14細(xì)胞壁對(duì)HT-29細(xì)胞周期的影響。

2.5 乳酸菌細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)對(duì)HT-29細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞周期分為DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）和細(xì)胞分裂期（M期）4個(gè)周期。乳桿菌X12、M5和K14細(xì)胞壁作用HT-29細(xì)胞后，其細(xì)胞周期變化情況見表4。

表4 乳酸菌細(xì)胞壁對(duì)HT-29細(xì)胞周期的影響Table 4 Effect of lactic acid bacteria cell wall on HT-29 cells cycle

本研究中細(xì)胞周期阻滯實(shí)驗(yàn)均與對(duì)照組Control進(jìn)行比較。相對(duì)于Control（G1期為70.11%），M5和X12細(xì)胞壁處理HT-29細(xì)胞后G1期顯著提高了（分別為76.06%和83.52%），同時(shí)M5的S期也顯著增高了（為22.92%），因此初步認(rèn)為M5和X12細(xì)胞壁將HT-29細(xì)胞周期阻滯在了G1期。相對(duì)于Control（S期為10.84%），K14細(xì)胞壁處理HT-29細(xì)胞S期顯著提高了（26.25%）。因此初步認(rèn)為菌株K14細(xì)胞壁將HT-29細(xì)胞阻滯在了S期。通過本研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌X12、M5和K14細(xì)胞壁抑制HT-29細(xì)胞的增殖，并誘發(fā)癌細(xì)胞的凋亡，這一過程是通過調(diào)控癌細(xì)胞周期而實(shí)現(xiàn)。

3 結(jié)論

本研究以鼠李糖乳桿菌LGG為陽性對(duì)照，研究4株乳酸菌X11、X12、M5和K14細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29細(xì)胞毒性、DNA損傷、細(xì)胞死亡及細(xì)胞周期的影響，篩選具有抗結(jié)腸癌作用的有效成分。結(jié)果表明，與陽性對(duì)照LGG相比，乳酸菌X11、X12、M5、K14細(xì)胞壁和乳酸菌M5、K14細(xì)胞質(zhì)對(duì)HT-29細(xì)胞增殖能力有顯著的抑制作用（P＜0.05）；HT-29細(xì)胞經(jīng)乳酸菌細(xì)胞壁或細(xì)胞質(zhì)（蛋白質(zhì)含量為80 μg/mL）處理48 h后，細(xì)胞DNA出現(xiàn)了明顯的彌散拖尾形態(tài)；乳酸菌X12、M5和K14細(xì)胞壁對(duì)HT-29細(xì)胞死亡具有顯著的誘導(dǎo)作用，并調(diào)控癌細(xì)胞的周期分布。通過以上篩選模式最終獲得乳酸菌X12、M5和K14的細(xì)胞壁成分具有抗結(jié)腸癌效果，為后續(xù)其對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。