竇俠，吳瑕，鐘偉龍，黃海艷，陳史宏，張杰，邵勇（北京大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東深圳518036）

胸腺基質(zhì)淋巴生成素（Thymic stromal lymphopoietin，TSLP）是一種上皮來源的白細(xì)胞介素（IL）-7樣的細(xì)胞因子，1994年由Friend等[1]首次從小鼠胸腺基質(zhì)細(xì)胞中鑒定。在人體，TSLP則主要由上皮來源的細(xì)胞產(chǎn)生，是誘發(fā)過敏性炎癥反應(yīng)的重要啟動(dòng)因子，例如在特應(yīng)性皮炎患者皮損中TSLP表達(dá)明顯上調(diào)并參與皮膚的Th2型炎癥反應(yīng)過程，同時(shí)TSLP還參與從特應(yīng)性皮炎到哮喘的特應(yīng)性進(jìn)程的發(fā)展[2-3]。近年研究發(fā)現(xiàn)TSLP除了介導(dǎo)過敏性炎癥反應(yīng)，還可直接與神經(jīng)元表面的受體結(jié)合參與瘙癢的發(fā)生[4]。結(jié)節(jié)性癢疹（Prurigo nodularis，PN）是一種以劇烈瘙癢搔抓并繼發(fā)表皮增生為特征的慢性皮膚病，目前對(duì)于其瘙癢及皮損發(fā)生的機(jī)制還了解甚少，而關(guān)于TSLP是否參與PN瘙癢的發(fā)生也未有相關(guān)研究。本研究目的即為探討TSLP及其2個(gè)異源受體亞單位胸腺基質(zhì)淋巴生成素受體（TSLPR）和白細(xì)胞介素-7受體α（IL-7RA）在PN皮損中的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集北京大學(xué)深圳醫(yī)院皮膚科門診經(jīng)臨床及組織病理確診的11例PN患者皮損中心區(qū)域及皮損周圍皮膚標(biāo)本，其中男6例，女5例，年齡 25～64歲，平均（47.91±12.48）歲。同時(shí)留取門診外科手術(shù)時(shí)無特應(yīng)性疾病及瘙癢性皮膚病的11例正常皮膚作為對(duì)照，對(duì)照組年齡24～38歲，平均（30.45±4.80）歲。本研究通過北京大學(xué)深圳醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 免疫組化染色 PN患者皮損中心組織和正常皮膚石蠟切片脫蠟至水化，3%H2O2溶液消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，檸檬酸鈉抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，山羊血清工作液封閉非特異性抗原，之后分別滴加稀釋的 TSLP（EMD Millipore，美國）、TSLPR（Biorbyt，英國） 和 IL-7RA（SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY，美國）一抗，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，4℃過夜，再滴加二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染、脫水封片。

1.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 將PN皮損中心區(qū)、皮損周圍及正常皮膚組織剪碎后于Trizol中-80℃保存，用于實(shí)時(shí)定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)步驟簡述如下：Trizol法提取皮膚組織總RNA，分光光度儀測(cè)定A260/A280比值判斷RNA純度并定量。依據(jù)Takara?逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系為10 μL，反應(yīng)條件為37℃15 min，85℃5 sec。根據(jù)Takara?定量PCR試劑盒步驟使用熒光定量 PCR儀（Bio Rad CFX96），并以 β-actin為內(nèi)參檢測(cè)待測(cè)皮膚中TSLP、TSLPR和IL-7RA的相對(duì)表達(dá)量，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為95℃3 min；95℃10 sec，72℃20 sec共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果通過計(jì)算2-ΔCt獲得目的基因的相對(duì)表達(dá)量（ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）。各引物序列如下：TSLP，5’-TAACCTTCAATCCCACCGCC-3’和 5’-GCGACGCCACAATCCTTGTA-3’；TSLPR，5’-AGCAGCGAGACGACATTCTC-3’和 5’-ACAGGTCAGAACACGTCACC-3’；IL-7RA，5’-ACCTGTGCTTTTGAGGACCC-3’和 5’-CAGGCACTTTACCTCCACGA-3’；β-actin，5’-GAGCACAGAGCCTCGCCTTT-3’和 5’-TCATCATCCATGGTGAGCTGGC-3’

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多個(gè)組間比較采用單因素方差分析或非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果 PN皮損部位與皮損周圍相比，皮損處TSLP、TSLPR和IL-7RA 3個(gè)分子mRNA相對(duì)表達(dá)量均略高于皮損周圍，但是二者之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.667，P=0.519；t=0.945，P=0.367；t=0.151，P=0.883）。分別對(duì) PN 皮損部位及皮損周圍各分子mRNA表達(dá)水平與正常皮膚進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，TSLP在mRNA水平的相對(duì)表達(dá)量與正常皮膚相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.810，P=0.429；t=0.448，P=0.659）。PN 皮損處 TSLPR 相對(duì)表達(dá)量高于正常皮膚，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.57，P=0.005 1），皮損周圍TSLPR相對(duì)表達(dá)量高于正常皮膚，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.659，P=0.128）。PN皮損處IL-7RA相對(duì)表達(dá)量高于正常皮膚，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.552，P=0.028 7），皮損周圍 IL-7RA 相對(duì)表達(dá)量高于正常皮膚，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.732，P=0.114），見圖 1。

2.2 免疫組化染色結(jié)果 TSLP以胞漿染色為主，PN皮損表皮全層TSLP染色均呈陽性，真皮內(nèi)散在陽性染色細(xì)胞，正常皮膚表皮全層TSLP染色也呈陽性。TSLPR以細(xì)胞膜表達(dá)為主，主要在PN皮損表皮棘層下部和基底層表達(dá)，真皮內(nèi)炎癥細(xì)胞部分呈陽性反應(yīng)，神經(jīng)束內(nèi)可見部分陽性反應(yīng)，正常表皮則在表皮基底層表達(dá)。IL-7RA表達(dá)廣泛，PN皮損表皮全層、真皮淺層血管及其周圍炎癥細(xì)胞均呈明顯的陽性反應(yīng)，正常表皮全層也呈陽性反應(yīng)，真皮內(nèi)散在陽性細(xì)胞，見圖2。

圖1 結(jié)節(jié)性癢疹患者皮損、皮損周圍及正常皮膚TSLP、TSLPR及IL-7RA mRNA表達(dá)水平的比較

圖2 結(jié)節(jié)性癢疹患者皮損及正常皮膚TSLP、TSLPR及IL-7RA

3 討論

PN是一種以頑固瘙癢為特點(diǎn)的皮膚病，既往對(duì)PN組織病理學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，皮損處真皮內(nèi)神經(jīng)纖維粗大及數(shù)量增多，同時(shí)有多種細(xì)胞如肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞參與PN的發(fā)病[5]。這些炎癥細(xì)胞和皮膚中固有的組成細(xì)胞可通過釋放各種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子如胰蛋白酶、IL-31、前列腺素、組胺及多種神經(jīng)肽類物質(zhì)促進(jìn)PN皮損處的末梢神經(jīng)病理性改變，并可能參與PN表皮肥厚和真皮結(jié)締組織增生的過程[6]。但是對(duì)于各種致癢介質(zhì)如何參與PN的瘙癢發(fā)生及皮損形成的具體分子機(jī)制目前尚未完全闡明。

已有研究證實(shí)TSLP是誘發(fā)并維持Th2相關(guān)過敏性炎癥的重要分子，參與特應(yīng)性皮炎、哮喘及過敏性鼻炎等疾病的免疫炎癥過程[7]。特應(yīng)性皮炎患者的角質(zhì)形成細(xì)胞受到各種刺激后可產(chǎn)生大量的TSLP，進(jìn)一步活化樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等，這些炎癥細(xì)胞除了參與誘發(fā)皮膚的濕疹樣炎癥反應(yīng)外，部分炎癥介質(zhì)或細(xì)胞因子還會(huì)作用于皮膚的神經(jīng)纖維，引起瘙癢癥狀。除了以上間接致癢作用外，近年研究還發(fā)現(xiàn)TSLP還可以直接作用于皮膚神經(jīng)纖維產(chǎn)生瘙癢癥狀，Wilson等[8]給小鼠頰部皮膚內(nèi)注射TSLP后，觀察到小鼠很快會(huì)出現(xiàn)顯著增多的搔抓行為，而在淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞缺失的小鼠中皮內(nèi)注射TSLP仍然可以誘發(fā)持續(xù)的搔抓行為，這提示TSLP可以不依賴于炎癥反應(yīng)過程而直接作用于神經(jīng)末稍來誘發(fā)瘙癢癥狀。皮膚內(nèi)感受瘙癢是由初級(jí)傳入軀體感覺神經(jīng)元介導(dǎo)的，該神經(jīng)元胞體位于脊髓背根神經(jīng)節(jié)，而神經(jīng)纖維則分布于皮膚內(nèi)感受癢覺刺激[9]。Wilson等[8]的研究還發(fā)現(xiàn)人和小鼠的脊髓背根感覺神經(jīng)元表面表達(dá)TSLP的2個(gè)異源受體亞單位TSLPR和IL-7RA，這也是TSLP可以直接刺激神經(jīng)纖維產(chǎn)生瘙癢信號(hào)的病理基礎(chǔ)。

本研究通過熒光定量PCR方法在mRNA水平比較了PN皮損和皮損周圍TSLP及其受體的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)皮損、皮損周圍與正常皮膚相比，TSLP的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而TSLP受體亞單位TSLPR和IL-7RA的表達(dá)在皮損部位則顯著高于正常皮膚，皮損周圍這2個(gè)受體的表達(dá)水平低于皮損中心部位而高于正常皮膚，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果提示雖然PN患者皮損處及皮損周圍TSLP表達(dá)并未顯著高于正常皮膚，但是皮損處TSLP的2個(gè)受體亞單位表達(dá)均顯著升高，對(duì)TSLP信號(hào)的感受性增強(qiáng)，提示TSLP-TSLPR通路可能參與PN瘙癢的發(fā)生。

筆者又通過免疫組化染色分析TSLP及2個(gè)受體亞單位在PN皮損內(nèi)的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在PN患者皮損處TSLP主要是由表皮角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生，TSLPR則主要在真皮部分炎癥細(xì)胞以及真皮神經(jīng)纖維表達(dá)，IL-7RA廣泛表達(dá)于表皮與真皮。由于TSLP主要通過結(jié)合TSLPR和IL-7RA異源雙鏈組成的受體來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，TSLPR是TSLP結(jié)合的特異性受體，但是親和力低，需要同時(shí)與提供高親和力結(jié)合位點(diǎn)的IL-7RA結(jié)合后產(chǎn)生活化信號(hào)[10]。因此根據(jù)筆者的研究結(jié)果可以推斷在PN發(fā)生的過程中，持續(xù)的搔抓促使角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生TSLP[11]，然后與神經(jīng)纖維表面TSLPR結(jié)合產(chǎn)生向上傳入的瘙癢信號(hào)，這可能是TSLP-TSLPR通路參與PN瘙癢發(fā)生的機(jī)制之一。

近期有研究比較了瘙癢性燒傷后瘢痕、非瘙癢性燒傷后瘢痕與正常皮膚內(nèi)TSLP及其受體的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)瘙癢性的燒傷后瘢痕處TSLP和TSLPR的表達(dá)顯著高于非瘙癢性瘢痕及正常皮膚，提示TSLP和TSLPR也是參與燒傷瘢痕部位瘙癢癥狀的致癢因子[12]。

基于以上的研究，針對(duì)TSLP-TSLPR通路的靶向治療有可能是未來治療瘙癢的方向之一。目前已經(jīng)有人源化的TSLP單克隆抗體AMG157以及TSLPR抑制劑MK8226在特應(yīng)性皮炎（AD）患者中進(jìn)行Ⅰ期臨床研究[13]。而Wilson等[8]的研究也發(fā)現(xiàn)環(huán)孢菌素在治療AD時(shí)能夠較快的緩解瘙癢，其機(jī)制有可能是通過抑制角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生TSLP從而達(dá)到有效止癢的作用，因此也可嘗試使用環(huán)孢菌素治療頑固的PN患者。

總之，本研究通過熒光定量PCR和免疫組化方法研究PN患者皮損、皮損周圍和正常皮膚TSLP及其受體的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PN患者皮損處TSLP的2個(gè)異源受體TSLPR和IL-7RA表達(dá)顯著升高，提示TSLP-TSLPR通路可能參與PN瘙癢的發(fā)生。