周兆明 馬思聰 文磊 成杰 劉浩 陳龍華 周美娟 周平坤 蔡林波 周成

1廣東三九腦科醫(yī)院腫瘤科，廣州 510510；2德國癌癥研究中心，海德堡69120；3上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院婦產(chǎn)科 200127；4南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院放射醫(yī)學系，廣州 510515；5南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院放療科，廣州 510515；6軍事科學院軍事醫(yī)學研究院輻射醫(yī)學研究所，北京 100850

以X射線為代表的光子射線在現(xiàn)代醫(yī)學影像學檢查與腫瘤治療中有著不可替代的作用[1]，包括CT、數(shù)字化X射線成像在內(nèi)的多種影像學檢查已成為各種胸部、縱膈、心血管疾病以及介入治療中最常用的輔助檢查手段。值得注意的是：一方面，隨之而來的正常組織射線暴露風險近年來也被廣泛關注[2]；另一方面，放療是肺癌及縱膈腫瘤、淋巴瘤的重要治療手段之一。放射性肺損傷（radiationinduced lung injury, RILI）是胸部放療的常見并發(fā)癥，也是限制腫瘤根治劑量的關鍵因素之一[3-4]。肺部作為輻射敏感器官，經(jīng)電離射線作用后可能引起放射性肺炎及肺纖維化等并發(fā)癥[5-6]。

目前，臨床上或輻射防護領域仍然缺乏有效監(jiān)測與評價RILI晚期改變的分子生物學標志物。當前對放射性肺炎或合并肺纖維化疾病的診斷主要依賴于臨床生化指標、影像學以及肺功能等檢查手段。受肺部的代償功能影響，這些常規(guī)檢查往往在靈敏度、特異度方面相對不足，而且結果容易出現(xiàn)滯后性，尚不能及時、準確地反映晚期慢性肺部病理生理學改變。纖維支氣管鏡結合有效基因標志物檢查可顯著提高早期輻射相關肺損傷的檢出率，從而為肺損傷相關疾病的精準診療提供有力證據(jù)。此外，RILI小鼠模型因其與人類有極為相似的慢性炎癥和纖維發(fā)生改變特征，是研究放射性肺部不良反應、特發(fā)性肺纖維化等疑難疾病機制的理想模型。本研究基于不同劑量X射線全肺野照射晚期小鼠肺組織，使用全基因組芯片研究輻射相關的差異表達基因，結合信號通路富集分析探討RILI潛在的基因標志物，并進行數(shù)學建模來預測與提示放射性肺疾病的發(fā)生、發(fā)展程度。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、分組及照射

8周齡C57BL6雌性小鼠共96只，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心[許可證號：SCXK（粵）2013-0002]，無特定病原體（SPF）級動物房飼養(yǎng)，溫度(23±1)℃，相對濕度(55±5)%，壓力差≤10 Pa，每日光照12 h，自由攝食飲水。①X射線單次照射實驗共分3組（12只/組）：對照組（未接受照射）、中等劑量組（MD組，小鼠接受10 Gy單次照射）、高劑量組（HD組，小鼠接受20 Gy單次照射）。②X射線全肺野分次劑量爬坡（梯度劑量照射）實驗共分5組（12只/組）：未接受照射（0 Gy組）、5次3 Gy照射（15 Gy組）、5次4 Gy照射（20 Gy組）、5次6 Gy照射（30 Gy組）和5次8 Gy照射（40 Gy組）。每日照射1次，連續(xù)照射5 d。使用異氟烷誘導配合氯胺酮麻醉小鼠，妥善固定后采用醫(yī)用直線加速器（德國西門子公司，6MVX型）進行全肺野照射，劑量率為3 Gy/min。

1.2 RNA樣本的處理及檢測

所有小鼠均于照射后24周予以斷頸處死，取新鮮肺部組織并用TRIzol試劑（賽默飛世爾中國）處理，置于-20℃冰箱凍存?zhèn)溆?。采用RNeasy Mini Kit （德國Qiagen公司）提取肺部RNA，使用DNase I（德國Qiagen公司）去除DNA，排除DNA污染，無核酸酶水洗脫純化RNA，樣本置于-20°C冰箱凍存?zhèn)溆谩２捎肗anoDrop ND-1000 分光光度計（德國PEQlab GmbH公司）初步測定RNA濃度，使用美國安捷倫科技（中國）有限公司的2100生化分析儀進一步測定RNA濃度以確認樣本的完整性和純度。采用全基因組表達芯片（美國Illumina公司的小鼠Sentrix-6 V2 全基因組芯片,BD-201-0202）進行RNA檢測，使用自帶軟件包處理芯片信號并生成基因表達矩陣。

1.3 數(shù)據(jù)轉換與差異基因的分析

采用R語言軟件（3.4.2版本）進行基因表達數(shù)據(jù)轉換，使用Limma軟件包[7]進行數(shù)據(jù)背景校正、標準化、數(shù)據(jù)匯總并報告差異表達基因，包括表達值log2對數(shù)轉換，設定基因表達變化倍數(shù)（fold change, FC）≥2，即log2(FC)＞1或log2(FC)＜-1，且P＜0.05為差異表達基因，得到小鼠受到不同劑量X射線照射后肺部差異表達基因，所有熱圖的圖例均為log2（FC）值。使用R語言軟件包對差異基因進行聚類分析，分析小鼠在接受梯度X射線照射后上述差異基因的表達情況。

1.4 質譜蛋白質組學的檢測

使用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質裂解物，將得到的凝膠切成13個切片，用胰蛋白酶消化并依文獻[8]所述進行質譜分析，即蛋白提取后，使用納升級超高效液相色譜（美國特世公司）連接至美國Thermo Fisher Scientific公司的LTQ Orbitrap質量分析器，將所得肽混合物進行在線偶聯(lián)。使用MaxQuant軟件（http://www.coxdocs.org，版本1.5.3.8）和小鼠UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）分析串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）原始數(shù)據(jù)。使用MaxQuant內(nèi)置MaxLFQ算法進行蛋白定量并采用Perseus軟件（http://www.coxdocs.org，版本1.5.2.4）進行數(shù)據(jù)轉換和評估。

1.5 基因表達劑量-效應曲線

為進一步驗證與研究基因標志物轉錄水平的改變與輻射劑量的直接關聯(lián)，對小鼠進行分次梯度劑量照射后，小鼠肺部上述RILI特征性基因標志物表達水平進行驗證與數(shù)學建模，采用Mathematica 8.0軟件（http://www.wolfram.com/mathematica）與OriginPro 8.0軟件 （https://www.originlab.com）進行建模。根據(jù)基因芯片結果，分別取上調(diào)、下調(diào)基因轉錄水平改變log2（FC）的平均值為縱坐標，不同梯度照射劑量為橫坐標，建立劑量-效應曲線。上調(diào)基因表達水平與X射線劑量關系擬合方程式為y = A1 + (A2-A1)/(1 + 10^((LOGx0-x)*p))，其中A1 = -0.06553±0.18433（最低點），A2 =1.48593±0.15206 (最高點)，LOGx0=19.9841±2.74032 (中心點)，p=0.07618±0.0284 (曲線斜率)。下調(diào)基因表達水平與X射線劑量呈明顯負相關，擬合方程式為y=a+b*x，其中a= 0.02218±0.13125(截距) 、b=-0.03551±0.00434(斜率)。

1.6 生物信息學分析

對基因表達水平進行基因集富集分析[9]，進行基因本體論[10]與京都基因和基因組百科全書通路[11]的基因集富集分析，采用聚類分析識別相關基因的表達水平。采用R語言軟件clusterProfiler軟件包[12]進行生物信息學分析，以P＜0.01且Q＜0.01作為篩選條件，使用ggplot2軟件包作圖。

1.7 統(tǒng)計學分析

使用Limma軟件包[7]中經(jīng)典貝葉斯檢驗方法進行組間差異表達基因分析，采用GraphPad Prism 7軟件進行輻射劑量相關基因表達數(shù)據(jù)分析及作圖。采用線性回歸模型分析兩組獨立數(shù)據(jù)的關聯(lián)程度，以皮爾森R2表示兩者關聯(lián)系數(shù)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RILI差異表達基因的篩選

不同劑量X射線照射后小鼠肺組織基因芯片的分析結果顯示，MD組出現(xiàn)125個顯著差異表達基因，其中32個基因表達上調(diào)、93個基因表達下調(diào)（圖1中A、C、D）。HD組接受單次照射后，基因表達差異表現(xiàn)更為明顯，共出現(xiàn)414個顯著差異表達基因，其中263個基因表達上調(diào)、151個基因表達下調(diào)（圖1中B、E、F）。

2.2 RILI基因標志物的分析結果

對MD組、HD組小鼠已篩選出的差異表達基因進行韋恩圖分析，結果發(fā)現(xiàn)有13個共同差異表達基因（圖2中A）。選取其中差異性表達最顯著的5個基因作為RILI潛在特征性基因標志物，包括3個顯著上調(diào)基因[PH同源域家族A成員3（pleckstrin homology like domain family A member 3，Phlda3）、纖維蛋白原γ鏈（fibrinogen gamma chain，F(xiàn)gg）、激肽原1（kininogen 1，Kng1）]和2個下調(diào)基因[蛋白質酪氨酸磷酸酶，B型受體（protein tyrosine phosphatase, receptor type B，Ptprb），KIT原癌基因受體酪氨酸激酶（KIT proto-oncogene receptor tyrosine kinase，Kit）]（表1）。該基因標志物組合在不同劑量照射組的表達趨勢差異明顯（圖2中B-C）。選取其中兩個上調(diào)基因進行蛋白質組學驗證后結果顯示，HD組相比對照組Fgg 、Kng1的表達差異倍數(shù)上升約為2倍左右（圖2中D）。

圖1 中等劑量（MD）組、高劑量（HD）組差異表達基因的火山圖（A-B）與基因表達熱圖（C-F） 圖中，MD組：10 Gy單次照射；FC：變化倍數(shù)；HD組：20 Gy單次照射。Fig.1 Volcano plots(A-B) and heatmaps of differentially expressed genes (C-F) in medium dose(MD) and high dose(HD) groups

2.3 基于RILI基因標志物表達水平的數(shù)學建模

梯度劑量照射后肺組織基因芯片結果顯示，3個特征性上調(diào)表達基因（Phlda3、Fgg、Kng1）均隨X射線劑量的增加而表達增強；2個特征性下調(diào)表達基因（Ptprb、Kit）則隨劑量的上升而表達降低（圖3中A）。這一結果與單次照射實驗結果一致，提示該基因標志物組合對不同劑量、不同分次X射線照射均具有較強的輻射敏感性。上調(diào)基因（Phlda3、Fgg、Kng1）的平均值通過邏輯回歸模型建模，模型擬合程度較高（χ2=11.66,R2=0.88）（圖3中B）。下調(diào)基因（Ptprb、Kit）進行線性回歸分析后結果顯示，下調(diào)基因表達水平與X射線劑量呈明顯負相關（R=-0.95，R2=0.89）（圖3中C）。

圖2 MD組和HD組共同差異表達基因分析結果 圖中，A：韋恩圖分析獲得13個差異基因；B：表達熱圖及聚類分析(對照組：未接受照射；MD組: 10 Gy單次照射；HD組：20 Gy單次照射)；C：MD、HD組共同差異基因與對照組比較的表達倍數(shù)變化。D：HD組與對照組Kng1 、Fgg蛋白表達水平的比較。Phlda3：PH同源域家族A成員3；Fgg：纖維蛋白原γ鏈；Kng1：激肽原1；Ptprb：蛋白質酪氨酸磷酸酶，B型受體；Kit：KIT原癌基因受體酪氨酸激酶。Fig.2 Analysis of common difference genes in medium dose(MD) and high dose(HD) groups

表1 小鼠經(jīng)X線全肺野照射后MD、HD組最顯著共同表達基因的信息Table 1 The most significant co-expression genes in medium dose(MD) and high dose(HD) groups after whole lung X-ray irradiation in mice

圖3 顯著差異基因表達差異倍數(shù)與梯度X射線照射劑量的相關性分析 圖中，A：基因表達熱圖；B、C： 差異表達基因與分次照射劑量擬合曲線。0 Gy組：未接受照射；15 Gy組：5次3 Gy照射；20 Gy組：5次4 Gy照射；30 Gy組：5次6 Gy照射；40 Gy組；5次8 Gy照射。Phlda3：PH同源域家族A成員3；Fgg：纖維蛋白原γ鏈；Kng1：激肽原1；Ptprb：蛋白質酪氨酸磷酸酶，B型受體；Kit：KIT原癌基因受體酪氨酸激酶。Fig.3 Correlation analysis between expression fold changes of difference genes and gradient X-ray exposure dose

2.4 基因集富集分析

2.4.1 KEGG通路集富集分析

對MD組和HD組小鼠基因表達水平進行KEGG通路基因集富集分析，結果顯示2組小鼠上調(diào)表達差異基因在p53、氧化磷酸化等多條信號通路出現(xiàn)富集（圖4中A），這提示X射線照射后小鼠肺部可能出現(xiàn)上述信號通路上調(diào)。p53信號通路先導基因分析結果顯示，MD、HD組分別有23個、26個基因的上調(diào)表達對p53信號通路上調(diào)產(chǎn)生作用（圖4中B、C）。

2.4.2 基因本體論基因集富集分析

對HD組小鼠基因表達水平進行基因本體論生物學功能基因集富集分析，結果顯示上調(diào)基因富集于固有免疫反應激活生物學過程（圖5中A），下調(diào)基因則富集于肺部發(fā)育和氣管發(fā)育等生物學過程（圖5中B、C）。先導基因分析結果顯示，49個基因的上調(diào)表達對激活固有免疫反應生物學過程產(chǎn)生作用，分別有11個基因、12 個基因的下調(diào)表達對抑制肺泡發(fā)育及肺細胞分化的生物學過程產(chǎn)生作用。

3 討論

針對疾病進展過程尋找可靠的生物標志物是“精準醫(yī)學”不可或缺的組成部分。基因標志物作為最直接快速有效的診斷手段之一，其篩選與應用可在疾病診斷、發(fā)展、治療以及療效監(jiān)測等多個方面發(fā)揮顯著作用。尋找放射性肺疾病相關基因標志物一直以來也是研究的熱點和難點[13]。迄今為止，臨床和放射防護領域針對間質性肺疾病的分子標志物檢測主要依靠血清學或蛋白質水平，如涎液化糖鏈抗原-6、表面活性蛋白A、基質金屬蛋白酶7、骨橋蛋白和東氨蛋白酶等，尚未開展基于轉錄水平基因標志物改變的肺損傷監(jiān)測和診斷[14-15]。本研究借助已建立成熟的小鼠RILI模型，為尋找可靠基因標志物開展臨床前實驗研究，分別從中、高等兩個輻照劑量入手，首先尋找肺組織輻射相關差異表達基因，并在此基礎上，根據(jù)已篩選出的敏感基因進一步尋找RILI潛在的基因標志物，并借助蛋白質組學進行蛋白水平的表達驗證。

圖4 MD組和HD組基因表達KEGG通路基因集富集分析結果 圖中，A: KEGG通路集富集分析結果圖，紅色點代表上調(diào)通路，綠色點代表下調(diào)通路，點的大小代表富集于該信號通路的基因數(shù)目。NES>0表示該信號通路上調(diào)，NES<0表示該信號通路下調(diào)。B～C: p53信號通路富集分析結果圖及相關基因表達熱圖，深紅色至深藍色代表基因表達水平由高到低。對照組：未接受照射；MD組：10 Gy單次照射；HD組：20 Gy單次照射；NES：標準化富集分數(shù)。FDR：錯誤發(fā)現(xiàn)率。Fig.4 Gene set enrichment analysis for KEGG in high dose (HD), medium dose (MD) groups and heatmap for associated genes in certain pathways

臨床醫(yī)師根據(jù)經(jīng)典放射生物學4R原則（Repair，Reoxygenation，Redistribution ，Repopulation），普遍采用分次照射對腫瘤病灶進行根治或姑息治療[16-17]。本研究第2部分實驗模擬分割照射的方式，采用梯度劑量爬坡、分次照射條件下的小鼠全肺野照射，對潛在RILI基因標志物進行進一步的驗證，結果證實該基因標志物組合與輻射劑量具有顯著相關性。上述結論也為基于該敏感基因組合進行劑量-效應建模奠定了生物學基礎。擬合模型結果顯示，上調(diào)基因（Phlda3、Fgg、Kng1）平均表達倍數(shù)超過1倍以上提示有較嚴重的肺損傷風險，其對應于約接受25 Gy（分5次照射）或以上劑量水平；當下調(diào)基因組合（Ptprb、Kit）平均表達差異倍數(shù)減少超過0.75時，提示有嚴重肺損傷風險，其相對的輻射劑量也在25 Gy（分5次照射）水平。

近年來的研究報道，X射線在腫瘤放療過程中，不僅對腫瘤細胞的DNA造成損傷，同時也會造成炎癥激活及促有絲分裂等信號通路激活[18]。本實驗采用基因集富集分析的方法，進行了KEGG信號通路富集和基因本體論生物學功能基因富集分析，結果顯示上調(diào)表達的差異基因往往與凋亡、溶酶體及吞噬體等信號通路激活相關，可引起急性免疫應答、白細胞介導的免疫反應、髓系白細胞增殖及其介導的免疫應答等一系列生物學過程激活。而下調(diào)表達的基因則富集于細胞代謝關鍵酶細胞色素P450，維生素A（抗腫瘤）代謝等諸多細胞代謝通路，這表明在高劑量X射線照射后，肺部細胞代謝通路受抑制。此外，肺部發(fā)育、氣管發(fā)育、上皮細胞增殖及血管發(fā)生等重要的肺部生物學過程，也受到抑制，上述信號通路及生物學過程提示了晚期RILI的發(fā)生發(fā)展機制。

圖5 HD組基因表達的基因本體論生物學功能基因集富集分析結果 圖中，A：固有免疫反應生活學過程相關基因表達上調(diào)；B：肺泡發(fā)育生物學過程相關基因表達下調(diào)；C：肺細胞分化生物學過程相關基因表達下調(diào)。基因表達熱圖中，深紅色至深藍色代表基因表達水平由高到低。GO：基因本體論；對照組：未接受照射；HD組：20 Gy單次照射；NES：標準化富集分數(shù)。FDR：錯誤發(fā)現(xiàn)率。Fig.5 Gene set enrichment analysis for GeneOntology terms in high dose (HD) group and heatmap for associated genes in certain biological processes

綜上所述，本研究通過全基因組芯片檢測X射線照射后24周小鼠肺部基因并進行轉錄水平分析，結果發(fā)現(xiàn)了可客觀反應RILI嚴重程度的潛在基因標志物，其中包括上調(diào)基因Phlda3、Fgg、Kng1與下調(diào)基因Ptprb、Kit。這些基因均屬首次報道，為將來開展臨床與輻射防護相關應用奠定前臨床基礎。此外，差異表達基因的富集分析提示炎癥、凋亡等通路激活，細胞代謝、肺部發(fā)育等通路受到抑制，同時對引起上述信號通路和生物學過程變化的相關基因進行了表達水平分析，確認了相關信號通路和生物學過程的決定基因簇。這些與晚期RILI相關的差異表達基因、信號通路及生物學過程改變有關，為進一步深入地研究RILI的發(fā)生發(fā)展機制提供了參考依據(jù)和理論基礎。