何茂旭，韓麗麗，王 佩，付 莉*，裴 越，劉盈盈，孫森森

(1.吉林大學第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，吉林 長春130041；2.青島市中心醫(yī)院 婦產(chǎn)科，山東 青島266042)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一,其病死率居婦科惡性腫瘤首位，患者5年生存率低于30%[1]。目前卵巢癌的治療主要以手術(shù)為主、放化療為輔綜合治療，但對于手術(shù)不能完全切除晚期患者，化療成為卵巢癌綜合治療的重要組成部分。然而化療藥耐藥性已成為卵巢癌治療的重要問題之一[2]。乙酰紫草素是一種天然的紅色色素，存在于我國傳統(tǒng)常見中藥—紫草的根中，具有抗炎和抗腫瘤活性[3]。乙酰紫草素對多種腫瘤細胞如結(jié)腸癌、胰腺癌及乳腺癌等具有一定的抑制作用[4-6]。本實驗主要探討乙酰紫草素是否能誘導卵巢癌SKOV3細胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：Multiskan FC型酶標儀(美國Thermo公司)，BD FACSVia型流式細胞儀(美國BD Biosciences公司)，Ti-E型熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。

試劑：乙酰紫草素(純度98%，上海純優(yōu)生物)，青霉素，鏈霉素，胰蛋白酶，MTT，1640培養(yǎng)液(Hyclone,US) ，胎牛血清(天津灝洋生物)，Annexin V/FITC及PI雙染試劑盒(Sigma，US)。

細胞：卵巢癌SKOV3細胞株(中國科學院上海細胞生物研究所)。

1.2 方法

1.2.1MTT法檢測SKOV3細胞的抑制率 將對數(shù)生長的卵巢癌SKOV3細胞懸液,以5×105個/mL密度接種在96孔板,每孔100 μl,每組設(shè)5個復孔。標準條件下培養(yǎng)過夜,于48小時加入含新的乙酰紫草素的培養(yǎng)液,乙酰紫草素每孔終濃度分別為1，5，10，20，30，40，50，60，70,80,90 μmol/L，對照組不加乙酰紫草素(只含等量培養(yǎng)基),各組細胞均培養(yǎng)48小時后加入10 μl MTT溶液(5 mg/mL)處理,加入100 μl DMSO,避光振蕩10 min,并通過酶標儀在490 nm波長下檢測每個孔的吸光度值(A),每組濃度重復檢測3遍,計算平均值,然后計算乙酰紫草素對SKOV3細胞的抑制率。抑制率(%)=(1-A實驗組/A對照組)×100%。

1.2.2流式細胞儀檢測細胞凋亡率 乙酰紫草素處理卵巢癌SKOV3細胞，PBS洗滌兩次并重懸于結(jié)合緩沖液中,然后加入5 μl Annexin V-FITC。此外，加入5μL PI,將細胞在室溫黑暗中孵育10 min,并通過流式細胞術(shù)測量凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 乙酰紫草素對卵巢癌細胞系SKOV3的抑制作用

本研究中不同濃度的乙酰紫草素對SKOV3細胞均有不同程度的抑制作用，當乙酰紫草素濃度低于40 μmol/L時，隨著乙酰紫草素濃度增加，對細胞的抑制率顯著增加，4種濃度(1、5、10、20 μmol/L)之間的抑制率有統(tǒng)計學差異，P<0.05。當乙酰紫草素濃度大于40 μmol/L后，抑制率不再明顯增加，進入平臺期。根據(jù)計算IC50為10.85 μmol/L(見圖1)。

2.2 應(yīng)用乙酰紫草素后SKOV3細胞周期和凋亡率的變化

本實驗選用乙酰紫草素IC50濃度(10.85 μmol/L)作用于卵巢癌SKOV3細胞，48小時后測量SKOV3細胞的凋亡率和細胞周期，結(jié)果見表2。

圖1 不同濃度乙酰紫草素對SKOV3細胞作用的量效曲線

3 討論

乙酰紫草素做為中國傳統(tǒng)中藥—紫草的主要成分，其藥理作用十分廣泛，現(xiàn)代藥學研究證明抗腫瘤作用是其主要作用之一[7]。已有研究證實乙酰紫草素能抑制多種腫瘤細胞增殖[8]。通過本實驗，我們發(fā)現(xiàn)乙酰紫草素也能抑制卵巢癌SKOV3細胞的生長，但具體機制尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌細胞中，乙酰紫草素可以誘導孤兒受體Nur77的表達和線粒體定位，從而誘導其發(fā)生凋亡。Liu[9]等人還發(fā)現(xiàn)乙酰紫草素可以通過TR3/Bcl-2途徑誘導Nur77線粒體轉(zhuǎn)運并誘導細胞凋亡,從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。因此，我們猜想，乙酰紫草素抑制卵巢癌SKOV3細胞生長的機制可能也與其誘導Nur77線粒體定位有關(guān)。并且已有相關(guān)文獻報道[10]在腫瘤細胞中,Nur77可能改變Bcl-2的表型作用于線粒體,最終導致細胞凋亡。由此也進一步為我們的猜想提供了一定的理論依據(jù)。

表2 乙酰紫草素作用后SKOV3細胞周期和凋亡率的變化

雖然我們通過這個實驗發(fā)現(xiàn)乙酰紫草素可以誘導卵巢癌SKOV3細胞凋亡，但是，其作用機制尚不清楚，仍需要進行更多的實驗研究來進行探索。進一步明確其抑制作用機制可能為開發(fā)新的抗卵巢癌藥物提供新的思路，亦可能開發(fā)出抗腫瘤藥物的新靶點。