譚 潔，李婧婷，邊學(xué)海

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 甲狀腺外科·吉林省外科轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室，吉林 長春130033)

組蛋白的乙?；揎楇x不開組蛋白去乙?；?HDACs)，HDACs可影響多種癌基因或抑癌因子的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞的惡性增殖和腫瘤的發(fā)生[1]。HDAC抑制劑在體外實驗中已證實可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，侵襲和遷移[2]，然而HDAC抑制劑在乳腺癌中的抗癌機(jī)制以及調(diào)控信號等方面知之甚少。miRNAs是19-25個核苷酸的非編碼RNA，在乳腺癌中異常表達(dá)，并為腫瘤行為和進(jìn)展起調(diào)節(jié)作用[3]。據(jù)報道m(xù)iR-200c可作為潛在腫瘤抑制因子，調(diào)節(jié)乳腺癌腫瘤血管生成、增殖、侵襲和遷移[4]。最近報道HDAC抑制劑與miR-200家族成員之間有直接關(guān)系[2]。據(jù)報道，銜接蛋白(CRKL)在人乳腺癌中過度表達(dá)，它作為腫瘤發(fā)生的啟動因子可能在乳腺癌的腫瘤增殖和遷移中起重要作用[5]，可能成為潛在的新型診斷標(biāo)志物和治療靶點。本研究探討HDAC-miR200c-CRKL信號軸在乳腺癌細(xì)胞調(diào)節(jié)中意義，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及HDAC抑制劑處理

人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231，HCC-1143，HCC-1395，MCF-7，SKBR3，HCC-1419和MDA-MB-361，及兩種正常的乳腺上皮細(xì)胞株MCF-10A和A1N4均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，細(xì)胞維持在含10%胎牛血清的RPMI-1640中。 MCF-7需在培養(yǎng)基中加入5 mg/mL胰島素生長。 MCF-10A和A1N4細(xì)胞在含0.5%胎牛血清、0.5 mg/mL氫化可的松、5 mg/mL胰島素和10 ng/mL表皮生長因子的IMEM中培養(yǎng)。 所有細(xì)胞在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中生長并保持，每3-4 d傳代一次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

hsa-miR-200c-3p模擬物(目錄號4464066)，hsa-miR-200c-3p抑制劑(目錄號4464084)和CRKL siRNA(目錄號4392420)購自美國ThermoFisher公司，通過Lipofectamine 2000進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。HDAC抑制劑Vorinostat(SAHA)購自美國Shelleckchem公司，用1 μM SAHA處理MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞24小時。

1.2 定量RT-PCR分析

用Trizol法從細(xì)胞提取總RNA。U6和β-Actin分別作為miR-200c和CRKL、HDAC1-11擴(kuò)增的內(nèi)參。用紫外分光光度計進(jìn)行定量，測量D260 nm/D280 nm比值定量PCR分析。PCR擴(kuò)增條件：95℃10分鐘，緊接95℃20秒和60℃30秒，36個循環(huán)。由PCR儀自帶軟件自動完成擴(kuò)增過程及數(shù)據(jù)分析。

1.3 Western-blotting印跡分析

使用RIPA緩沖液提取處理細(xì)胞的總蛋白質(zhì)。加載蛋白質(zhì)并在10%SDS-PAGE凝膠上分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉以1∶10 000稀釋度將膜在4℃與抗CRKL的單克隆抗體溫育過夜。用TBST洗滌后，膜與1∶20 000稀釋度的抗小鼠IgG孵育1小時，按DAB顯色試劑盒說明進(jìn)行DAB顯色。用凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描，進(jìn)行吸光度分析，計算與其對應(yīng)的內(nèi)參條帶的比值表示蛋白質(zhì)水平。使用ImageJ軟件測量蛋白質(zhì)條帶定量。

1.4 細(xì)胞增殖測定

通過MTT法測定MDA-MB-231細(xì)胞的活力和增殖。將以1×104個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔培養(yǎng)液總量100 μl，并留用SAHA處理。孵育24、48、72、96 h后，每孔加入20 μl的MTT，并在37℃下再溫育2 h，在酶譜儀測量490 nm處吸光度值。

1.5 基質(zhì)膠侵襲實驗

為反映細(xì)胞浸潤能力，在用miR-200c模擬物轉(zhuǎn)染或用SAHA處理后，將5×104/孔細(xì)胞接種于適配于24孔培養(yǎng)板的BioCoat Matrige培養(yǎng)小室中。 使上室細(xì)胞在37℃、5%CO2孵育箱中過夜。棉簽擦去上室內(nèi)未侵入的細(xì)胞。侵入細(xì)胞用100%乙醇固定15分鐘，蘇木精-伊紅染色，40倍放大光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)拍攝10個視野并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，取平均值。

1.6 劃痕實驗

為反映細(xì)胞遷移能力，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種在6孔板中，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到80%時，去除上清液并用無菌200 μl移液槍頭沿板中線劃痕，用PBS清洗碎片。使用倒置顯微鏡在不同時間點獲得連續(xù)照片。測量并記錄刮痕兩側(cè)細(xì)胞前端之間的距離。

1.7 統(tǒng)計分析

每個實驗重復(fù)三次。應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，各組之間的統(tǒng)計學(xué)差異使用t檢驗或χ2檢驗進(jìn)行分析。P<0.05為有差異；P<0.01為顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-200c在乳腺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，與HDAC IIa成員的表達(dá)水平反比

與正常乳腺上皮細(xì)胞株相比，miR-200c在乳腺癌細(xì)胞株中均呈低表達(dá)；在三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231，HCC-1143和HCC-1395中顯著低表達(dá)(圖1 A)。相反，HDAC2和IIa類HDAC包括HDAC9，HDAC4，HDAC5和HDAC7在乳腺癌細(xì)胞株中呈高表達(dá)(圖1 B)；尤其HDAC9在所有乳腺癌細(xì)胞株中均顯著高表達(dá)。結(jié)果顯示，miR-200c與HDAC2和IIa類HDACs的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。

2.2 過表達(dá)miR-200c可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，侵襲和遷移

將miR-200c模擬物轉(zhuǎn)染到MDA-MB-231中以過表達(dá)miR-200c(圖2A)。過表達(dá)miR-200c顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖和生長(圖2A)。基質(zhì)膠侵襲實驗結(jié)果表明，過表達(dá)miR-200c轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲性顯著降低(圖2B)。劃痕實驗結(jié)果表明，miR-200c的過表達(dá)抑制了細(xì)胞的遷移(圖2C)。結(jié)果支持miR-200c對乳腺癌增殖，侵襲和遷移起重要的抑制作用。

圖1 (A) miR-200c在乳腺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)。(B) HDAC9，HDAC4，HDAC5和HDAC7在乳腺癌細(xì)胞株中呈高表達(dá)，尤其HDAC9在所有乳腺癌細(xì)胞株中均顯著高表達(dá)

圖2 (A) miR-200c模擬物轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞與非轉(zhuǎn)染細(xì)胞，24,48,72或96 h增殖分析，與對照相比，*P<0.05和**P<0.01。 (B) 100 nM miR-200c轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞與非轉(zhuǎn)染細(xì)胞，基質(zhì)膠侵襲16 h后對比。(C) 100 nM miR-200c轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞與非轉(zhuǎn)染細(xì)胞，劃痕實驗24 h、48 h后對比。

2.3 miR-200c直接靶向CRKL作用

CRKL在乳腺癌細(xì)胞株中均呈高表達(dá)，表明在乳腺癌細(xì)胞中，miR-200c水平與CRKL呈反相一致。為了鑒定miR-200c靶基因，利用生物信息學(xué)分析掃描了基因組中推定miR-200結(jié)合位點，并將CRKL鑒定為miR-200的預(yù)測靶基因。用miR-200c模擬物轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后，Western blotting分析CRKL的蛋白表達(dá)，顯示過表達(dá)miR-200c使CRKL表達(dá)下調(diào)了約68%(圖3)。

2.4 HDAC抑制劑通過調(diào)節(jié)miR-200c和CRKL抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲

為了證實miR-200c是HDAC抑制劑的抗癌機(jī)制的功能性介質(zhì)，將SAHA作為本研究的典型HDAC抑制劑。先用miR-200c抑制劑轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞，再用SAHA處理，結(jié)果顯示，SAHA處理后miR-200c表達(dá)上升(圖4A)，相反CRKL表達(dá)下降(圖4B)；顯著降低乳腺癌細(xì)胞的增殖并阻止其侵襲。通過用100 nM miR-200c抑制劑轉(zhuǎn)染下調(diào)miR-200c可部分削弱SAHA對乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的抑制。

圖3 分別用100 nM miR-200c抑制劑或1 nM,10 nM和100 nM miR-200c模擬物的對MDA-MB-231細(xì)胞處理24小時。通過蛋白質(zhì)印跡試驗，異位miR-200c表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞的CRKL表達(dá)水平。 β-Actin用做對照。與對照相比，*P<0.05和**P<0.01。

圖4 (A)用1 μM SAHA單獨處理或SAHA及100 nM miR-200C抑制劑聯(lián)合處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h，然后RT-PCR定量分析miR-200c表達(dá)水平，與對照相比，*P<0.05和**P<0.01。 (B)用1 μM SAHA，100 nM miR-200c，100 nM CRKL siRNA單獨處理或SAHA及 miR-200c抑制劑的聯(lián)合處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h，然后Western印跡分析CRKL表達(dá)水平，與對照相比，*P<0.01

3 討論

乳腺癌是女性惡性腫瘤死亡的主要原因之一[6]。與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的表觀遺傳學(xué)改變成為近年研究熱點。HDAC抑制劑在乳腺癌中的抗癌機(jī)制目前尚不清楚。本研究結(jié)果表明HDAC抑制劑部分通過miR-200c下調(diào)CRKL表達(dá)，發(fā)揮抑制乳腺癌細(xì)胞發(fā)展、侵襲等的作用，為HDAC抑制劑治療乳腺癌機(jī)制提供了新證據(jù)。

miR200家族成員作為潛在抑制因子與乳腺癌的生長，遷移和侵襲相關(guān)[7]。我們的研究顯示miR-200c在乳腺癌細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)；在用miR-200c模擬物轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞后，明顯抑制了腫瘤細(xì)胞增殖，侵襲和遷移；相反，抑制miR-200c表達(dá)時，可促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移。因此，這些結(jié)果表明miR-200c抑制乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。

本項研究證實：乳腺癌細(xì)胞中，miR-200c的直接靶標(biāo)是CRKL。提高外源性miR-200c表達(dá)可顯著降低CRKL蛋白水平。在用miR-200c抑制劑轉(zhuǎn)染MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞，抑制miR-200c表達(dá)后，呈現(xiàn)CRKL蛋白表達(dá)上調(diào)。因此，miR -200c表達(dá)水平與CRKL蛋白水平呈負(fù)相關(guān)。CRKL作為致癌基因在許多惡性腫瘤中呈過度表達(dá)。CRKL過度表達(dá)在乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲中發(fā)揮作用，并與不良預(yù)后顯著相關(guān)[8]。研究結(jié)果首次確定CRKL蛋白水平與miR-200c表達(dá)之間呈顯著負(fù)相關(guān)性，這為乳腺癌提供一種新的診斷標(biāo)記和潛在的治療靶點。

我們的數(shù)據(jù)顯示在HDAC抑制劑處理后，乳腺癌細(xì)胞中miR-200c的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而CRKL表達(dá)在mRNA和蛋白質(zhì)水平均下調(diào)。已有研究表明，HDAC抑制劑可以激活基因表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長和存活，HDAC抑制劑可作為潛在治療癌癥的新藥。Vorinostat是美國FDA批準(zhǔn)用于治療皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的第一個HDAC抑制劑[9]。HDAC抑制劑已證實能誘導(dǎo)p21Waf1/Cip1 mRNA的表達(dá)而抑制腫瘤的增殖[10]。最近研究，HDAC抑制劑SAHA可通過誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移[11]。而HDAC抑制劑在乳腺癌中下游抗癌機(jī)制以及信號傳導(dǎo)是否涉及其他表觀遺傳變化仍然不清楚。本研究結(jié)果證實miR-200c表達(dá)降低削弱了HDAC抑制劑在乳腺癌細(xì)胞中的抑制功能，表明miR-200c與HDAC抑制劑在抗乳腺癌過程中的相互作用。此外，miR-200c通過下調(diào)CRKL表達(dá)而抑制細(xì)胞增殖，遷移和侵襲。研究中，當(dāng)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-200c抑制劑時，不完全阻斷SAHA抑制細(xì)胞增殖和侵襲的作用。我們認(rèn)為HDAC抑制劑SAHA抗癌作用至少部分通過miR-200c-CRKL軸來實現(xiàn)。

總之，本項研究表明miR-200c是通過下調(diào)CRKL水平來抑制乳腺癌的增殖，侵襲和遷移的。明確HDAC抑制劑的抗癌作用部分是通過調(diào)節(jié)miR-200c直接靶向CRKL來實現(xiàn)的。因此，HDAC-miR200c-CRKL信號軸可能在HDAC抑制劑抗乳腺癌機(jī)制中起重要作用。本研究揭示了HDAC抑制劑臨床治療乳腺癌的理論，并提示HDAC-miR200c-CRKL信號軸可能成為乳腺癌新的診斷標(biāo)志物和潛在的治療靶點。