曲若寧，李麗靜，吳曉光

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 藥學(xué)部，吉林 長(zhǎng)春130033;2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 藥學(xué)部;3.河北省中藥開發(fā)與研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

腦缺血再灌注損傷是多種機(jī)制參與的復(fù)雜病理過程，而腦組織持續(xù)性缺血缺氧誘發(fā)神經(jīng)元凋亡，為梗死灶擴(kuò)大和遲發(fā)型神經(jīng)元損傷的主要機(jī)制[1，2]，凋亡決定了最終梗死體積[3]。因此，研制抑制細(xì)胞凋亡的藥物，可有效減輕缺血性腦損傷的程度[4]。山楂葉總黃酮(TFHL)是中藥山楂葉中黃酮類化合物的總稱，具有抗自由基、抑制炎癥反應(yīng)過程等藥理作用，目前臨床廣泛應(yīng)用于心血管疾病[5]。本研究以線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注(MCAO)模型，觀察TFHL對(duì)腦缺血再灌注損傷的作用及其對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3表達(dá)的影響，旨在從細(xì)胞凋亡角度探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)雄性SD大鼠90只，(8-9)月齡，體質(zhì)量230-250 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證書：scxk(京)2006-2009。

1.2 動(dòng)物模型建立參照Longa[6]法并加以改進(jìn)，采用線栓法建立左側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞局灶性腦缺血再灌注(MCAO)模型。線栓采用0.235 mm釣魚線，自頸外動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈直至大腦中動(dòng)脈起始部，插入深度距頸動(dòng)脈分叉約18.5±1 mm，2 h后拔除線栓實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組5只，除不插入線栓外其他操作同模型組。大鼠清醒后，參照Bederson[7]等方法，對(duì)MCAO大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分：0分，無任何神經(jīng)損傷癥狀；1分，提尾時(shí)右前肢屈曲；2分，爬行時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，自發(fā)運(yùn)動(dòng)時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈，成追尾狀或向右側(cè)傾斜；4分，不能自然行走或意識(shí)完全喪失。選取1-3分者入實(shí)驗(yàn)，選出有效模型75只，隨機(jī)分為模型組、TFHL低、中、高劑量組和陽性對(duì)照組，每組15只。

1.3 給藥劑量與方法以TFHL為治療藥物，銀杏葉片為陽性對(duì)照藥物，灌胃給藥，連續(xù)36 d。TFHL低、中、高劑量組給藥劑量為70、140、280 mg·kg-1·d-1，銀杏葉片給藥劑量為24 mg·kg-1·d-1。假手術(shù)組和模型組給予等量的生理鹽水。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1TTC染色 末次給藥后1 h，每組隨機(jī)取6只，斷頭取腦，-20℃冰箱凍存3 min，蠟板上行冠狀切片，片厚2 mm，共切5片。將腦片置于2%TTC中染色，37℃恒溫孵育60 min。數(shù)碼相機(jī)拍照，應(yīng)用MiVnt病理圖形分析系統(tǒng)測(cè)量腦梗死面積和全腦面積并計(jì)算腦梗死體積占大腦總體積的百分比。

1.4.2電鏡觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的改變 末次給藥后1 h，每組隨機(jī)取3只，30mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛和2.5%戊二醛混合液左心室插管灌注固定后，體式顯微鏡下選取缺血邊緣區(qū)1 mm3大小腦皮質(zhì)，3.5%戊二醛后固定，用于超微結(jié)構(gòu)觀察。

1.4.3腦組織切片病理學(xué)檢查 末次給藥后1 h，每組隨機(jī)取6只，30 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛左心室插管灌注固定后，斷頭取腦，在蠟板上選取腦組織視交叉至大腦橫裂冠狀腦組織，依次脫水、透明、浸蠟及包埋，Leica石蠟切片機(jī)連續(xù)冠狀切片，片厚5 μm，4℃冰箱保存,備用。常規(guī)HE染色、封片，光鏡下觀察并拍照。

1.4.4免疫組化檢測(cè) 兔抗Caspase-3單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)santa公司，SP免疫組化試劑盒購(gòu)于北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司，DAB顯色試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物技術(shù)有限公司。取上述4℃冰箱保存?zhèn)溆玫拇竽X切片，常規(guī)脫蠟脫水，按試劑盒說明書操作步驟操作，DAB顯色，光鏡下Caspase-3陽性染色呈棕黃色。陰性對(duì)照片用PBS代替一抗，其余操作相同。拍照，再M(fèi)ivnt顯微圖像分析系統(tǒng)下進(jìn)行半定量分析。對(duì)采集圖片中的棕黃色顆粒進(jìn)行密度掃描，測(cè)平均灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 山楂葉總黃酮對(duì)MCAO大鼠腦梗死體積的影響

假手術(shù)組大鼠腦片呈均勻的紅色，未見梗死灶，其他各組缺血側(cè)皮質(zhì)、紋狀體、蒼白球部分區(qū)域呈現(xiàn)不同程度的梗死區(qū)(圖1)。但與模型組比較，TFHL各組腦梗死體積明顯減少(表1)。

a:假手術(shù)組；b:模型組;c:L-TFHL;d:M-TFHL;e:H-TFHL;f:銀杏葉片

圖1 MCAO大鼠缺血區(qū)腦梗死體積(TTC 染色 )

2.2 山楂葉總黃酮對(duì)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響

電鏡顯示假手術(shù)組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元染色質(zhì)均勻，各種細(xì)胞器如線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等結(jié)構(gòu)界限清晰；模型組神經(jīng)元腫脹，各種膜結(jié)構(gòu)溶解、斷裂、不連續(xù)，染色質(zhì)凝集、邊集，線粒體或出現(xiàn)嵴斷裂、空泡化或致密，嵴分辨不清，其它細(xì)胞器明顯減少；TFHL各組神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷減輕(圖2)。

2.3 山楂葉總黃酮對(duì)MACO大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)、密度的影響

由圖3可見，假手術(shù)組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊緊密，可見3-4層細(xì)胞，染色均勻，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核大而圓，核仁清晰；模型組大部分神經(jīng)元變性壞死，正常神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，排列紊亂，細(xì)胞周圍間隙加大，細(xì)胞核濃縮、深染、溶解或消失，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)不清；TFHL各組神經(jīng)元損傷明顯減輕，正常神經(jīng)元數(shù)量明顯增多，排列稍規(guī)則，但仍可見部分神經(jīng)元變性，核仁不清，核固縮或消失。

模型組的正常神經(jīng)元密度(ND)計(jì)數(shù)明顯降低，與假手術(shù)組比較，具有極顯著差異(P<0.01)，提示缺血再灌注造成了海馬CA1區(qū)神經(jīng)元丟失；與模型組比較，TFHL各組神經(jīng)元密度有所升高，且呈劑量依賴性(表2)。

2.4 山楂葉總黃酮對(duì)MCAO大鼠缺血區(qū)Caspase-3表達(dá)的影響

免疫組化法檢測(cè)Caspase-3陽性染色光鏡下呈棕黃色，陽性區(qū)域在神經(jīng)元細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)。假手術(shù)組海馬神經(jīng)元中僅少量表達(dá)，棕黃色染色較淺；模型組海馬神經(jīng)元胞核出現(xiàn)大量棕黃色顆粒，染色較深，為強(qiáng)陽性；TFHL70、140和280 mg·kg-1·d-1組36d Caspase-3蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量明顯減少。見圖4。

a:假手術(shù)組；b:模型組;c:L-TFHL組;d:M-TFHL組;e:H-TFHL組;f:銀杏葉片

圖3 TFHL對(duì)MCAO大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)的影響(HE染色400×)

注：與假手術(shù)組比較：*P<0.01；與模型組比較：#P<0.05,##P<0.01

山楂葉總黃酮對(duì)Caspase-3 平均光密度比值的影響。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬Caspase-3 蛋白表達(dá)的光密度比值顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，TFHL70、140和280 mg·kg-1·d-1三組36 d光密度比值分別降低，說明TFHL能顯著抑制海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Caspase-3蛋白的表達(dá)。見表2。

3 討論

海馬和皮層是公認(rèn)的缺血易損區(qū)，而海馬CA1區(qū)又是海馬各段缺血損傷最敏感的區(qū)域，故本研究的主要觀察對(duì)象為海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞和皮層。結(jié)果表明，TFHL能明顯減少M(fèi)CAO大鼠腦梗死體積，減輕海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷，證明TFHL對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用，這與其他學(xué)者研究結(jié)果相一致[8]。另外，本研究發(fā)現(xiàn)TFHL對(duì)腦缺血再灌注損傷的改善作用與劑量呈正相關(guān)，劑量越大，這種改善作用越明顯，且TFHL280 mg·kg-1·d-1組36 d在減少腦梗死體積，減輕神經(jīng)元損傷和抑制caspase-3等方面與銀杏葉片24 mg·kg-1·d-1組36 d比較無顯著差異性，這為TFHL藥用開發(fā)提供了新的依據(jù)，雖然達(dá)到同樣治療效果的前提下，TFHL用量要大得多，但TFHL資源豐富，彌補(bǔ)了銀杏葉資源不足的現(xiàn)狀。

a:假手術(shù)組；b:模型組;c:L-TFHL;d:M-TFHL;e:H-TFHL;f:銀杏片

Caspase-3是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)信號(hào)通路下游關(guān)鍵的執(zhí)行蛋白酶[9，10]，在神經(jīng)發(fā)育乃至腦缺血等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過程中發(fā)揮著重要作用[11],腦缺血性損傷可激活Caspase-3蛋白，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[12]，藥物干預(yù)可抑制細(xì)胞凋亡[13]。本研究結(jié)果顯示，TFHL各組Caspase-3表達(dá)較模型組顯著減少，凋亡神經(jīng)元數(shù)量減少。腦缺血再灌注模型組核膜溶解或斷裂、染色質(zhì)濃集，線粒體嵴斷裂、空泡化嵴分辨不清，符合細(xì)胞凋亡過程中重要的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改特征[14]，提示TFHL可能通過抑制Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑達(dá)到對(duì)腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。本研究從細(xì)胞凋亡角度探討了山楂葉總黃酮和腦缺血再灌注損傷的關(guān)系，研究結(jié)果為研究防治缺血性腦血管病藥物提供了依據(jù)。