孫亞冬，王家祥，崔樹德*

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 1.乳腺科；2.外科，河南 鄭州450008)

乳腺癌是全球范圍內(nèi)女性最常見的惡性腫瘤，死亡率僅次于肺癌為第二位[1]。乳腺癌的預(yù)后與疾病分期及生物分型密切相關(guān)，目前早期診斷仍然是治愈的關(guān)鍵[2]，如何尋找敏感性高、特異性高并且可以用于早期診斷和篩查的生物指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)尚處于亞臨床病變階段的腫瘤對臨床意義重大[3,4]。本研究通過收集乳腺癌患者和正常健康女性的血清標(biāo)本，應(yīng)用表面增強(qiáng)激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)，分別研究乳腺癌術(shù)前組與健康對照組、乳腺癌術(shù)前組與術(shù)后組、三陰性乳腺癌組與非三陰性乳腺癌組之間血清蛋白質(zhì)譜的變化特征，以期尋找到相關(guān)的血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物，進(jìn)而對于乳腺癌的早期診斷、療效評價(jià)及不同亞型的預(yù)后分析提供一定幫助。然后聯(lián)合MALDI-TOF-MS、Tricine-SDS-PAGE和Western blot 等多種蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對篩選出的目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和驗(yàn)證，最終確定乳腺癌血清特異蛋白標(biāo)記物，從而為乳腺癌的早期診斷及三陰性乳腺癌的潛在靶點(diǎn)尋找依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 血清樣本收集與處理

收集鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院女性乳腺癌患者資料總計(jì)60例，時(shí)間自2011年06月至2014年6月，其年齡范圍為23-70歲，平均年齡為46.7+0.4歲，病理明確診斷為乳腺癌，所有患者入組前未接受治療，診斷明確后均接受手術(shù)治療，術(shù)后規(guī)范接受化療、放療或內(nèi)分泌治療。其中確診為三陰性乳腺癌的患者占22例。同時(shí)收集健康女性的血清樣本20例，設(shè)為健康對照組。所有參與實(shí)驗(yàn)的患者及健康對照者，都已了解相關(guān)內(nèi)容，并征得知情同意。

入組乳腺癌患者術(shù)前、對應(yīng)術(shù)后2周的標(biāo)本，兩組均為60例。所有患者均在清晨06:30-7:30抽血留取標(biāo)本，要求空腹?fàn)顟B(tài)，標(biāo)本于室溫下靜置0.5-1 h，然后放入離心機(jī)進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速3 000 r/min，離心時(shí)間20-30 min，離心后標(biāo)本抽取上清液至EP管，做好標(biāo)記后放入-80℃冰箱保存。

1.2 儀器和設(shè)備

SELDI-TOF-MS、96孔蛋白芯片(Bioprocessor)、SELDI芯片、WCX芯片、CHAPS(3-環(huán)乙胺-1-丙磺酸)、乙腈(Acetonitrile)、DTT(1,4-二硫代蘇糖醇)、TEMED(四甲基乙二胺)均購于美國Ciphergen公司，MALDI-TOF-MS購于英國Kratos Analytical公司，真空冷卻離心濃縮系統(tǒng)(SPD SpeedVac)購于美國Thermo Electron Inc公司，胰蛋白酶(Trypsase)于美國Promega Inc公司。

1.3 方法

1.3.1血清樣本的處理 解凍血清標(biāo)本，室溫下溶解，然后離心(4℃，10 000 r/min)，將離心后的樣本加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入5 μl樣本，然后加入10 μl U9緩沖液，并加入1% Bar、2%CHAPS各10 μl，放入4℃層析柜內(nèi)，振蕩大約30 min，500 r/min。

1.3.2SELDI-TOF-MS技術(shù)篩選血清樣本 將芯片裝入加樣器Bioprocessor中，每孔中加入NaAC(100 mmol/L，pH4)200 μl，放入層析柜中，以600 r/min振蕩2 min，然后重復(fù)上述操作過程1次。將經(jīng)過U9處理后的96孔板Bioprocessor置于冰盒上，加入NaAC185 μl，這一步驟使用排槍操作，然后再次放入層析柜中，4℃條件下，600 r/min震蕩2 min。在蛋白質(zhì)芯片上加入已處理的樣本100 μl，放置于層析柜中，4℃條件下，600 r/min結(jié)合60 min，然后甩去殘液，快速拍干。加入NaAC200 μl，600 r/min振蕩5 min后，方法同前，以上操作重復(fù)3次。使用200μl去離子水將各孔沖洗兩次，仔細(xì)甩干，將芯片風(fēng)干，每孔加入50%飽和的SPA 1 μl，分兩次進(jìn)行，等待芯片干燥后上機(jī)。設(shè)置參數(shù)如下：分子量范圍為2000Da-20000Da，最高分子量為30000Da，使用Ciphergen Biosystems 軟件(3.1版)校正原始試驗(yàn)數(shù)據(jù)，使數(shù)據(jù)的總離子強(qiáng)度和分子量實(shí)現(xiàn)均一化；使用Biomarker Wizard軟件包和ZUCI-ProteinChip Data軟件包來過濾噪音和去除基線。并檢測儀器的運(yùn)行情況及靈敏度，然后把裝有檢測樣本的蛋白質(zhì)芯片板放入質(zhì)譜儀中，通過MELDI-TOF-MS系統(tǒng)，進(jìn)行數(shù)據(jù)收集，并應(yīng)用相應(yīng)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，分別獲取到各個(gè)樣本的m/z峰(質(zhì)/荷比)，數(shù)據(jù)中差異性<0.3% 的被認(rèn)為是同一種蛋白質(zhì)。

1.3.3乳腺癌血清中特異性蛋白質(zhì)的鑒定 根據(jù)SELDI-TOF-MS篩選出的乳腺癌特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記物，即(m/z)位于6448的蛋白質(zhì)或肽段，選取6448的蛋白質(zhì)或肽段峰值高表達(dá)的血清樣本進(jìn)行純化及鑒定。對樣本進(jìn)行篩選后制備凝膠，收集乳腺癌組樣品血清2 ml，然后加入超純水，稀釋至5 ml，再進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Tricine-SDS-PAGE)分離，步驟如下：把兩塊玻璃板(厚度為0.75 mm)清洗干凈，夾緊固定于膠架上，先后加入分離膠和濃縮膠，需要等待膠體完全凝固后進(jìn)行上樣，將5 μl指示劑加入到前期處理后的樣本中，沸水浸泡，約15-20 min，取出，然后5000 r/min離心，時(shí)間5 min，然后取上清液10 μl，小心加至膠體梳齒槽中，將Marker加入第一槽作為參照。然后將初始電壓設(shè)為30 v，待樣本電泳到濃縮膠與分離膠的分界處時(shí)，調(diào)至電壓為100 v，繼續(xù)電泳4-6 h小時(shí)以后，等待指示劑接近膠體底部的時(shí)候，關(guān)掉電源，取出玻板，將濃縮膠和分離膠進(jìn)行分離，濃縮膠進(jìn)行移除，仔細(xì)分離分離膠并放入清潔培養(yǎng)皿中進(jìn)行考馬斯亮蘭染色，染色時(shí)間為6-8小時(shí)。將染色成功后的分離膠進(jìn)行切取，用標(biāo)記好的EP管分裝。參照膠內(nèi)酶解試劑盒的說明書，經(jīng)酶解得到目標(biāo)蛋白。向樣本中加入提取液，然后對上清液進(jìn)行提取，將基質(zhì)添加至上清液后，在蛋白質(zhì)芯片板上進(jìn)行點(diǎn)樣，然后放入MALDI-TOF/TOF中，經(jīng)過激光轟擊，肽段序列進(jìn)行收集，然后利用Mascot軟件，繼而與Swiss Prot數(shù)據(jù)庫連接、進(jìn)行匹配和比對，最終得到目標(biāo)蛋白質(zhì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，通常通過噪音過濾和聚類分析，對篩選出的m/z峰進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，并對不同實(shí)驗(yàn)組質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.01。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組與健康對照組間的比較

將乳腺癌組與健康對照組之間的蛋白質(zhì)譜進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，再進(jìn)行聚類分析，得到兩組各自的差異蛋白峰值，然后對兩組蛋白峰值進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，共收集到14個(gè)具有差異性的蛋白峰值(P<0.01)，其中有11個(gè)在乳腺癌組呈高表達(dá)，3個(gè)在乳腺癌組呈低表達(dá)。通過SVM回歸，篩選出其中Youden指數(shù)最高的模型，差異蛋白峰為定位于6448的蛋白質(zhì)標(biāo)記物，與健康人群相比，在乳腺癌患者中，m/z峰定位于6448的蛋白標(biāo)記物低表達(dá)。其在乳腺癌組低表達(dá)強(qiáng)度為38.0187±34.2194，而在正常組高表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度為337.5261±507.6438，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1、2)。

圖1 m/z 6448 在各組中的對比質(zhì)譜圖(0為正常組，1為乳腺癌組)

圖2 m/z 6448 在不同組中的模擬電泳圖，紅色條帶處(0為正常組，1為術(shù)前組)

2.2 乳腺癌術(shù)前組與術(shù)后組間的比較結(jié)果

對乳腺癌術(shù)前組與術(shù)后組進(jìn)行質(zhì)譜分析，得到具有差異性的蛋白質(zhì)峰值(P<0.01)，共篩選出6個(gè)，其中有4個(gè)在乳腺癌術(shù)前組呈高表達(dá)，2個(gè)低表達(dá)。通過支持向量機(jī)(SVM)，將Youden指數(shù)最高的模型篩選出來，最終得到m/z峰位于6448的蛋白標(biāo)記物，其在術(shù)前組表達(dá)強(qiáng)度為38.0187±34.2194，術(shù)后組表達(dá)強(qiáng)度為294.1245±102.8634，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3、4)。

2.3 三陰性乳腺癌組與非三陰性乳腺癌組的比較結(jié)果

采用SELDI-TOF-MS技術(shù)平臺對三陰性乳腺組與非三陰性乳腺癌組進(jìn)行質(zhì)譜分析，得到具有差異性的蛋白質(zhì)峰值(P<0.01)，共篩選出9個(gè)，其中有4個(gè)在三陰性乳腺癌組低表達(dá)。通過SVM篩選出Youden指數(shù)最高的模型，也可以得到m/z峰位于6448的蛋白標(biāo)記物，其在三陰性乳腺癌中表達(dá)強(qiáng)度為5.1351+3.6437，非三陰性乳腺癌組表達(dá)強(qiáng)度為43.6162±18.8542，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000163，<0.01)(圖5、6)。

圖3 m/z 6448在各組中的對比質(zhì)譜圖(0為乳腺癌術(shù)前組，1為術(shù)后組)

圖4(m/z) 6448在不同組中的模擬電泳圖，紅色條帶處(0為術(shù)前組，1為術(shù)后組)

圖6 m/z 6448在不同組中的模擬電泳圖，紅色條帶處(0為非三陰性乳腺癌組，1為三陰性乳腺癌組)

2.4 特異性蛋白質(zhì)的鑒定

以Marker所提供的分子量作為參照標(biāo)尺，切取相對應(yīng)的分子量軸上目標(biāo)蛋白條帶，然后進(jìn)行酶解離心，再取上清液，使用MALDI-TOF/TOF技術(shù)獲取到肽段混合物并對其進(jìn)行檢測鑒定。結(jié)果顯示，含有m/z6448的純化液經(jīng)過檢測得到的蛋白片段(表1)，將檢測出的m/z為6448Da的蛋白質(zhì)肽段樣品進(jìn)行酶解，然后通過MALDI-TOF/TOF系統(tǒng)進(jìn)行肽段檢測。m/z為6448 Da的蛋白質(zhì)或肽段其序列為：LK EFGNTLEDKA RELISRIKQS ELSAKMREWF SETFQKVKEK，將肽段導(dǎo)入SEQUEST檢索程序并在Bioworks數(shù)據(jù)庫檢索，此肽段為載脂蛋白C-I(apolipoprotein C-I,APO C-I)。圖7為鑒定m/z為6448Da的蛋白質(zhì)或肽段酶解的部分肽段的質(zhì)譜圖。

表1 質(zhì)荷比為6448Da的蛋白質(zhì)或肽段及其酶解后的肽段序列

圖7 鑒定質(zhì)荷比為6448Da的蛋白質(zhì)或肽段酶解的部分肽段質(zhì)譜圖

3 討論

本研究通過SELDI-TOF-MS蛋白質(zhì)芯片技術(shù)篩選出質(zhì)荷比(m/z)為6448的蛋白質(zhì)峰，然后聯(lián)合MALDI-TOF-MS、Tricine-SDS-PAGE等技術(shù)對篩選出的目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和驗(yàn)證，質(zhì)荷比6448蛋白質(zhì)為載脂蛋白C-I肽段(ApoC-I)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)載脂蛋白C-I肽段在乳腺癌患者血清中明顯降低，顯著低于健康對照人群；而患者術(shù)后血清中載脂蛋白C-I肽段有上升趨勢；在三陰性乳腺癌組表達(dá)低于非三陰性乳腺癌組。這一結(jié)果不僅發(fā)現(xiàn)了可以用于乳腺癌早期診斷和檢測預(yù)后的新型生物指標(biāo)，而且提示我們載脂蛋白ApoC-I肽段對乳腺癌有一定的保護(hù)性作用，載脂蛋白ApoC-I肽段與腫瘤細(xì)胞增殖分化可能呈負(fù)相關(guān)。因?yàn)槲覀兛吹阶鳛槿橄侔﹣喗M中惡性程度最高、侵襲性最強(qiáng)、轉(zhuǎn)移能力最強(qiáng)的三陰性乳腺癌組，這一蛋白質(zhì)肽段的表達(dá)更低，它的生物學(xué)作用和機(jī)制需要進(jìn)一步探索。

三陰性乳腺癌約占乳腺癌的15%-20%，是乳腺癌所有分子分型里預(yù)后最差、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)最高的一種亞型，因?yàn)槿狈τ行У闹委熓侄?，僅僅對化療敏感，內(nèi)分泌治療和分子靶向治療均不敏感，因此，三陰性乳腺癌的治療一直是困擾臨床多年的難題，目前越來越多的研究試圖尋找三陰性乳腺潛在的治療靶點(diǎn)[5,6]。我們的研究發(fā)現(xiàn)m/z峰定位于6448的蛋白標(biāo)記物在侵襲性較高的三陰性乳腺癌中表達(dá)低于非三陰性乳腺癌，這也提示我們這一蛋白標(biāo)記物的降低與乳腺癌腫瘤惡性程度的升高可能相關(guān)，初步建立了SELDI-TOF-MS蛋白質(zhì)芯片技術(shù)結(jié)合SVM的乳腺癌血清尤其是三陰性乳腺癌血清蛋白篩選模型[7]。

目前，關(guān)于載脂蛋白與腫瘤關(guān)系的研究還非常少，以往對于載脂蛋白的研究主要集中在其對脂蛋白代謝的調(diào)節(jié)上[8-10]，近年來有一些研究報(bào)道了載脂蛋白C-I在細(xì)胞功能調(diào)節(jié)方面的作用，除了在脂質(zhì)代謝方面的作用，一些激酶可以被載脂蛋白C-I激活或抑制，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)生理或病理過程的作用，與癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Yasui等[11]通過基因表達(dá)分析(SAGE)發(fā)現(xiàn)與正常胃上皮細(xì)胞相比，載脂蛋白C-I在胃癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)等。Christine等[12]通過對胰腺癌組織進(jìn)行原位雜交發(fā)現(xiàn)，載脂蛋白C-I在侵襲性胰腺癌組織中高表達(dá)。Yamamoto-Ishikawa等[13]對激素耐藥的前列腺癌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)載脂蛋白C-I定位于這類前列腺癌的細(xì)胞質(zhì)中，在疾病進(jìn)展過程中血清載脂蛋白C-I蛋白表達(dá)水平升高。這些結(jié)果都表明載脂蛋白C-I可能參與了多種類型的癌癥的發(fā)生及發(fā)展過程，目前參與發(fā)病的確切機(jī)制還不清楚，值得進(jìn)一步探討。Goncalvesa等[14]一項(xiàng)對乳腺癌術(shù)后病人血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究，篩選并鑒定出差異蛋白質(zhì)為載脂蛋白AI和載脂蛋白CI，并且發(fā)現(xiàn)兩者在術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組均呈低表達(dá)。這一結(jié)論和我們的研究結(jié)果非常類似，均提示載脂蛋白CI的低表達(dá)可能與乳腺癌較差的預(yù)后有關(guān)。同時(shí)再次印證了血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究對于預(yù)測乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有一定積極的臨床意義。

綜上所述，ApoC-I肽段在乳腺癌患者中明顯低于健康人群，術(shù)后隨著瘤荷的降低ApoC-I肽段隨之升高，而且在侵襲性較強(qiáng)、惡性程度較高的乳腺癌亞型中ApoC-I肽段的表達(dá)更低，是因?yàn)槟[瘤的發(fā)生導(dǎo)致ApoC-I的表達(dá)量消耗性下降，還是因?yàn)锳poC-I的表達(dá)量下降而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，二者之間的作用機(jī)制及原理，均有待更深入研究。